Artículo de método

Un juego de herramientas para la conversión de hidrocarburos en ambientes acuosos

DOI:

10.3791/4182

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2 de octubre de 2012

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1Department of Biotechnology, Delft University of Technology, 2Delft Center for Systems and Control, Delft University of Technology

En este artículo

Resumen

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Un auto sostenible sistema de regulación de las bacterias para la remediación de contaminaciones de aceite ha sido diseñado utilizando piezas estándar de ADN intercambiables (BioBricks). Una ingeniería E. coli se utiliza para degradar alcanos a través de β-oxidación en ambientes acuosos tóxicos. Las respectivas enzimas de diferentes especies mostraron actividad de degradación de alcano. Además, una mayor tolerancia a N-Hexano se obtuvo mediante la introducción de genes de alcano bacterias tolerantes.

Resumen

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Este trabajo expone un conjunto de herramientas que permite la conversión de alcanos por Escherichia coli y presenta una prueba de principio de su aplicabilidad. El juego de herramientas se compone de varias piezas estándar intercambiables (BioBricks) 9 abordan la conversión de alcanos, la regulación de la expresión génica y la supervivencia en tóxicos ambientes ricos en hidrocarburos.

Una vía de tres pasos para la degradación de alcano se llevó a cabo en E. coli para permitir la conversión de alcanos a medio y largo de cadena a sus respectivos alcanoles, alcanales y, finalmente, ácidos alcanoicos. Este último se metaboliza a través de la nativo β-oxidación vía. Para facilitar la oxidación de alcanos de cadena media-(C5-C13) y cicloalcanos (C5-C8), cuatro genes (alkB2, rubA3, rubA4 y Rubb) del sistema hidroxilasa alcano de Gordonia sp. TF6 8,21 se transformaron en E. coli. Para la conversión de losalcanos de cadena larga (C15-C36), el gen Lada de Geobacillus thermodenitrificans fue implementado. Para conocer los pasos necesarios adicionales del proceso de degradación, ADH y ALDH (procedente de thermodenitrificans G.) se introdujeron 10,11. La actividad se midió mediante ensayos de células en reposo. Para cada etapa oxidativa, la actividad enzimática se observó.

Para optimizar la eficacia del proceso, la expresión fue inducida sólo bajo condiciones bajas de glucosa: un promotor regulado sustrato, pCaiF, se utilizó. pCaiF está presente en E. coli K12 y regula la expresión de los genes implicados en la degradación de fuentes de carbono distintas a la glucosa.

La última parte del conjunto de instrumentos - focalización supervivencia - se implementó el uso de genes de tolerancia, solventes PhPFDα y β, ambos de Pyrococcus horikoshii OT3. Disolventes orgánicos pueden inducir estrés celular y la disminución de la supervivencia de forma negativa affecting plegamiento de proteínas. Como chaperones, PhPFDα y β mejorar el proceso de plegamiento de proteínas por ejemplo en virtud de la presencia de alcanos. La expresión de estos genes condujeron a una tolerancia mejorada de hidrocarburos se muestra por una tasa de crecimiento mayor (hasta 50%) en la presencia de 10% de n-hexano en el medio de cultivo se observaron.

En resumen, los resultados indican que el kit de herramientas permite E. coli para convertir y tolerar hidrocarburos en ambientes acuosos. Como tal, representa un primer paso hacia una solución sostenible para la recuperación de petróleo mediante un enfoque de la biología sintética.

Introducción

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La contaminación por petróleo se encuentra entre las causas más graves de contaminación ambiental y afecta en gran medida a los ecosistemas, las empresas y las comunidades 3. Por ejemplo, se requieren soluciones para combatir la continua contaminación por petróleo que se origina en las arenas bituminosas que resiguen las aguas de cola en Alberta, Canadá. Durante el proceso de extracción de petróleo de las arenas bituminosas, el betún, una forma oxidada semisólida de petróleo, se elimina utilizando técnicas de recuperación térmica que consumen alrededor de 3,1 barriles de agua por barril de petróleo 1. El agua de proceso contaminada con petróleo, que se origina principalmente en un río local, se almacena en estanques de relaves después de la extracción de betún. Es necesario un reciclaje más eficaz del agua de proceso para reducir la necesidad de absorción de agua dulce. Para facilitar la extracción de betún y garantizar que los sitios aguas abajo cumplan con las pautas de calidad del agua para la protección de los ecosistemas acuáticos, los tratamientos de agua de proceso están evolucionando rápidamente 3.

Para tratar la contaminación de compuestos orgánicos, actualmente se fomentan las tecnologías de biorremediación que emplean microorganismos 1. Los alcanos son la familia más abundante de hidrocarburos en el petróleo crudo, conteniendo de 5 a 40 átomos de carbono por molécula 7, 21. Se sabe que muchas bacterias degradan alcanos de varias longitudes a través de la oxidación secuencial del grupo metilo terminal, formando primero alcoholes, luego aldehídos y finalmente ácidos grasos. Dentro de este proyecto iGEM se expresaron y caracterizaron varias enzimas de diferentes organismos, y se pusieron a disposición a través del estándar BioBrick y el Registro de Partes Biológicas Estándar.

El bien estudiado sistema de alcano hidroxilasa de Gordonia sp. TF6 facilita el paso inicial de oxidación de los alcanos C5-C 13 junto con el de los cicloalcanos C5-C 8 utilizando un mínimo de cuatro componentes: alkB2 (alcano 1-monooxigenasa), rubA3, rubA4 (dos rubredoxinas) y RubB (rubredoxina reductasa) 8, 21. Se ha informado que la oxidación de alcanos de cadena larga (que van desde C15 hasta C36) es realizada por ladA, una flavoproteína alcano monooxigenasa de Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 7, 15, 18, 22. LadA forma un complejo catalítico con mononucleótido de flavina (FMN) que utiliza el oxígeno atómico para la oxidación. Esto da como resultado la conversión de alcanos en el alcanol primario correspondiente. Los alcoholes son oxidados por el alcohol y los aldehídos deshidrogenasas a ácidos grasos, que entran fácilmente en la vía de β-oxidación 7, 21. Una alcohol deshidrogenasa independiente del zinc de la bacteria termófila Geobacillus thermoleovorans B23 oxida los alcanoles de cadena media en sus respectivos alcanos, utilizando NAD+ como cofactor 10. La aldehído deshidrogenasa de la misma bacteria es capaz de catalizar el paso final dependiente de NAD+ en la oxidación de cadena media 11.

Con el fin de reducir los costos de inducción y mantener una proliferación óptima del sistema bacteriano, se caracterizó el promotor pCaiF de E.coli. Este promotor puede regular la expresión de los componentes de la vía de degradación de hidrocarburos, y está regulado por los niveles de AMPc-Crp, que a su vez dependen de los niveles de glucosa 6. A altas concentraciones de glucosa extracelular en el medio ambiente, el nivel celular de AMPc (fosfato mononucleótido de adenosina cíclico) fue bajo debido a la inhibición de la adenilil ciclasa como efecto secundario del transporte de glucosa mediado por PTS. Por el contrario, durante la limitación (bajas concentraciones de glucosa) el nivel de AMPc aumentó y la Crp se unió al AMPc formando el complejo, cAMP-Crp, que se unió a pCaiF y activó la transcripción de los componentes posteriores 6, 14.

La E. coli de tipo salvaje solo puede tolerar concentraciones moderadas de hidrocarburos. Para completar el conjunto de herramientas, hubo que abordar la tolerancia a los hidrocarburos. Se sabe que varias bacterias orgánicas tolerantes a solventes sobreviven en sistemas bifásicos de agua-solvente 12. Los componentes moleculares conocidos por aumentar la tolerancia son chaperonas que facilitan el correcto plegamiento de las proteínas. Se demostró que el sistema de prefoldina de Pyrococcus horikoshii OT3, compuesto por las proteínas phPFDα y phPFDβ, aumenta la tolerancia a los hidrocarburos 17.

El kit de herramientas de conversión de alcanos se construyó siguiendo el principio BioBrick, que está documentado en el Registro de Partes Biológicas Estándar 9. Los BioBricks son plásmidos que contienen un inserto funcional específico que está flanqueado por 4 sitios de restricción predefinidos. Los insertos BioBrick se pueden ampliar de forma flexible, lo que permite la construcción de sistemas biológicos con nuevas funciones.

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Protocolo

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1. BioBrick Asamblea

  1. BioBricks del Registro de partes biológicas estándar son proporcionados por la sede iGEM. Para construir un nuevo BioBrick de BioBricks existentes, digerir el donante BioBrick (hasta 1,0 g) con las enzimas EcoRI y SpeI para el posicionamiento de las partes aguas abajo de los donantes de la parte aceptor. Se digiere con XbaI y PstI para posicionar la parte donante aguas arriba de la parte aceptor. Añadir una tercera enzima de restricción apropiada que corta en la columna vertebral de la donante. Realizar las digestiones en un volumen total de 20-25 ml con el tampón apropiado, de acuerdo con el proveedor (concentración final 1x). Usar 5 unidades / g de ADN para las enzimas de restricción.
  2. Se digiere el aceptor BioBrick ya sea con EcoRI y XbaI o SpeI y PstI.
  3. Incubar las digestiones para (al menos) una hora a 37 ° C. Inactivar las endonucleasas de restricción por el calor, la incubación a 80 ° C durante 10 min y se centrifuga en breve.
  4. Se liga el BioBrick digeridopartes (donante y aceptor) juntos. Dado que XbaI y SpeI generar extremos compatibles de ADN, un sitio mixto se crea que no se puede cortar con cualquier enzima de restricción que resulta en una nueva "combinado" que BioBrick flanqueado por los sitios de restricción estándar 4. En la mezcla de ligación a la concentración final de ADN es preferiblemente ~ 100 ng / l. Realizar la reacción de ligación en un volumen total de 10-15 ml con el tampón de ligación T4 (concentración final 1x) y la T4 ligasa (1 unidad / g de ADN).
  5. Incubar la mezcla de ligación a 16 ° C durante al menos 3 h.
  6. Realizar reacción de transformación con medio circa de la mezcla de ligadura.
  7. Confirme la BioBrick ser correcta con la secuenciación.
  8. Para construir un nuevo BioBrick de ADN sintetizado, modificar los genes para la síntesis para la expresión óptima en E. coli por medio de la herramienta de la página web JCat ( http://www.jcat.de/ ). Realizar modificaciones adicionales de acuerdo con los requisitos de la B ioBrick estándar. Esta normalización implica que cada BioBrick se compone de una secuencia de ADN de interés precedido por un prefijo y seguido de un sufijo. El prefijo y el sufijo son secuencias que contienen sitios de restricción predefinidos, que están ausentes en la secuencia del plásmido restante. Estos sitios de restricción estándar hacen posible el intercambio y extender los insertos BioBrick flexible 9. El prefijo y sufijo tienen las siguientes secuencias:
Nombre Secuencia Comentario
Prefijo 5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3'
5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3' Si la siguiente parte es una secuencia de codificación o cualquier parte que comienza con "ATG"
Sufijo 5 'TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3'
ove_title "> 2. Alkane Análisis de Conversión célula en reposo, En Vivo

Este ensayo se realizó según el método descrito por Fujii et al. (2004).

  1. Cultura E. células de E. coli que expresan el sistema hidroxilasa alcano ( BBa_K398014 ) y las que contienen un vector vacío ( BBa_J13002 ) en 5 ml de medio LB con los antibióticos apropiados durante la noche.
  2. Transferir 500 l de cultivo de una noche en 50 ml de LB fresco (con antibióticos) y se incuba hasta que la turbidez celular alcanzó una DO (densidad óptica) de 0,3 a 600 nm.
  3. Centrifugar durante 10 min a 4.000 rpm y resuspender el sedimento en 5 ml de tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4).
  4. Se centrifuga de nuevo durante 10 min a 4.000 rpm y resuspender el sedimento en 5 ml de tampón de fosfato 0,1 M que contiene ahora sales E2 y 0,66% v / v de glicerol (nitrógeno-deficienmedio t).
  5. Medir la turbiedad de células (OD 600).
  6. Preparar la mezcla de células de alícuotas de 6 ml en matraces de 25 ml de vidrio cerrado de la tapa y no de células controles (sales de E2 + 0,66% v / v de glicerol).
  7. Añadir 100 nmol de alcano a cada matraz.
  8. Incubar las mezclas a 37 ° C durante 24 hr (acortar cuando se obtienen tasas más altas).
  9. Mida la OD 600 después de incubación.
  10. Extraer los hidrocarburos en los medios de cultivo por acetato de etilo y determinar la concentración de hidrocarburos en cultivo celular por cromatografía de gases (véase el protocolo 3).
  11. Calcular la degradación por unidad de biomasa dividiendo la cantidad total de alcano convertido por la biomasa total presente en cada matraz (OD 600 convertir a peso seco). Dividiendo el resultado por la duración experimental produce la actividad de degradación por unidad de biomasa por unidad de tiempo. El promedio se toma de tres carreras individuales.

3. Alkane Conversion Ensayo enzimático, EnVitro

Este ensayo se realizó esencialmente según el método descrito por Li et al. (2008).

  1. Cultura E. células de E. coli que expresan el gen LADA ( BBa_K398017 ) y las células que llevan un vector vacío ( BBa_J13002 ) en 50 ml de medio LB con los antibióticos apropiados durante la noche.
  2. Transferir 500 l de cultivo de una noche en 50 ml de LB fresco (con antibióticos) y se incuba hasta que la turbidez celular alcanzó una densidad óptica de 0,6 a 600 nm.
  3. Centrifugar 10 minutos a 4.000 rpm (4 ° C) y resuspender el sedimento en 5 ml de 50 mM de tampón Tris.
  4. Baño de ultrasonidos (disruptor celular, LA Biosystems) las células en ciclo de trabajo de 40% con un control de salida de 4, mantener la solución en hielo durante toda la duración.
  5. Centrifugar la mezcla resultante durante 5 min a 4.000 rpm a 4 y dpor ejemplo, C para eliminar los restos celulares. Transferir el sobrenadante a un vial nuevo.
  6. Determinar la concentración de proteína total de los extractos celulares mediante ensayo de Bradford. Nota: Usar frascos de vidrio para evitar el aumento de fondo y / o la pérdida de proteína.
  7. Preparar una mezcla de 100 ml que contiene 0,1% v / v alcano y 50 mM de tampón Tris-HCl.
  8. Calentar la mezcla a 100 ° C durante 5 min. Nota: Realice este paso sólo para alcanos de cadena media de duración con alto punto de ebullición. (Por ejemplo, C 16: 287 ° C).
  9. Para conseguir una solubilidad óptima del alcano, sonicar durante 1 min mientras está todavía caliente hasta obtener una mezcla homogénea y viscosa se obtiene.
  10. Añadir 1 mM de NADH, 1 mM FMN, 1 mM MgSO 4 y 0,01 v / v Triton X-100.
  11. Preparar alícuotas de 6 ml en 25 ml cerrado la tapa frascos.
  12. Añadir una cantidad adecuada de extracto de células (depende de ensayos de Bradford, concentración final de 5 mg de proteína / l). Preparar un control sin proteína.
  13. Incubar a 60 ° C (para el correo óptimanzymatic actividad) durante 24 horas.
  14. Extraer los hidrocarburos en los medios de cultivo por acetato de etilo y determinar la concentración de hidrocarburos en cultivo celular por cromatografía de gases (véase el protocolo 3).
  15. Calcular la degradación por unidad de biomasa dividiendo la cantidad total de alcano convertido por proteína total a cada matraz (por Bradford curva de calibración). Además dividir por duración del experimento se obtiene la actividad de degradación por unidad de proteína celular por unidad de tiempo. El promedio se toma de tres carreras individuales.

4. Acetato de etilo de extracción de hidrocarburos y Medidas de concentración

  1. Alcanos se extrae de la solución acuosa mediante la adición de 2,5 ml de acetato de etilo (apolar solvant) a 6 ml de solución experimental. Un patrón interno se añade al disolvente en una concentración de 0,1% (v / v). El estándar (por ejemplo, ciclo-decan) varió en función de la gama prevista de los picos de interés.
  2. Opcional: Añadir TritonX-100 a la mezcla acuosa y centrifugar las muestras durante 10 min a 4.000 rpm con el fin de obtener un adecuado sistema bifásico.
  3. Vórtice de la mezcla durante 5 seg (1.500 rpm) y se incuba a temperatura ambiente hasta que las dos fases separadas.
  4. Eliminar una cantidad máxima de la capa orgánica (superior) y secar el solvente usando sulfato de magnesio anhidro.
  5. Retire MgSO 4 por filtración (0,2 m) y transferir el filtrado en viales de cromatografía de gases para mediciones o almacenar a -20 ° C.
  6. Determinar la concentración por cromatografía de gases utilizando una columna de CP-SIL 5CB (longitud = 5 m). Inyectar 10 ul de muestra en modo de división (1:10, 230 ° C). Establecer el flujo de gases en columna a 1 ml / min (helio). El programa de temperatura del horno se utiliza la siguiente:
    Velocidad Temperatura [° C] Tiempo [min]
    0 50 7,5
    50 90 1,0
    50 110 2,0
    50 130 2,0
    50 145 2,0
    50 160 2,0
    50 170 2,0
    50 185 2,0
    50 210 2,0
    50 250 2,0
    50 320 2,0
  7. Integrar los picos y corregir las concentraciones con respecto al patrón interno.

5. Alcohol / aldehído deshidrogenasa Ensayo de actividad

Este ensayo se realizó esencialmente según el método descrito por Kato et al.(2010).

  1. Cultura E. células de E. coli que expresan la ADH ( BBa_K398018 ) o ALDH ( BBa_K398030 ) de genes y las células que llevan un vector vacío ( BBa_J13002 ) en 50 ml de medio LB con los antibióticos apropiados durante la noche.
  2. Transferir 500 l de cultivo de una noche en 50 ml de LB fresco (con antibióticos) y se incuba hasta que la turbidez celular alcanzó una densidad óptica de 0,6 a 600 nm.
  3. Centrifugar 10 minutos a 4.000 rpm a 4 ° C y resuspender el sedimento en 5 ml de 50 mM de tampón Tris.
  4. Someter a ultrasonidos la solución de células en ciclo de trabajo del 40% con un control de salida de 4 (mantener la solución en hielo durante la sonicación).
  5. Centrifugar la mezcla resultante durante 5 min a 4.000 rpm a 4 ° C para eliminar los restos celulares.
  6. Determinar la queTal concentración de proteína de los extractos celulares mediante ensayo de Bradford (Nota: use un vial de vidrio para prevenir la proteína de unión).
  7. Cargar una placa de 96 pocillos con 180 l 57 mM de glicina tampón que contenía NAD (concentración final 1 mM, pH 9,5) en cada pocillo.
  8. Añadir 5 l de alcohol (aldehído) a ensayar a los pocillos. Nota: alcoholes de cadena larga de calor antes del comienzo del ensayo de tener un líquido. Para cada alcohol (aldehído) un control sin sustrato debe ser añadido (control negativo). Además, preparar un blanco que contiene una mezcla de tampón y sustrato sin el extracto celular.
  9. Precalentar la placa del lector de placas (Tecan Magellan v7.0) durante 15 min a 37 ° C para permitir el equilibrio del sistema.
  10. Añadir una cantidad adecuada de extracto de células (depende de ensayos de Bradford, concentración final de 5 mg de proteína / l). Preparar un control sin proteína.
  11. Medir la producción de NADH usando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 340 nm cada 2-3 min durante 1 hora a 37 ° C.
  12. Cálculo de la tasa de producción de NADH a partir de la pendiente de la OD (340 nm). Tener en cuenta la longitud de la trayectoria de la luz y el coeficiente de extinción de la NADH de 6220 M -1 cm -1. Divide la tasa de producción de NADH por la cantidad total de proteína añadida para expresar la actividad de la deshidrogenasa de reacción en el extracto celular (U / mg de proteína celular total). Calcular la media y la desviación estándar de tres carreras independientes.

6. Caracterización pCaiF

  1. Cultura E. células de E. coli que expresan el constructo pCaiF-GFP ( BBa_K398331 ) y las células que llevan el promotor solo ( BBa_K398326 ) durante la noche en 5 ml de medio LB durante la noche los antibióticos apropiados.
  2. Inocular 5 ml M9 que contenía 10 g / l de glucosa y los antibióticos con 50 l de cultivo de una noche y crecer durante la noche.
  3. Subculture 50 l de la noche a la mañana excrecencia en 5 ml de M9 fresco g with10 / l y se incuba hasta que la turbidez celular alcanzó una densidad óptica de 0,2 a 600 nm.
  4. Cargar una placa de 96 pocillos con 100 l de medio M9 fresco que contiene la cantidad deseada de fuente de carbono para la prueba en cada pocillo. Lleve a cabo tres experimentos para la evaluación estadística y añadir los respectivos controles negativos (tipo salvaje E. coli K12).
  5. Añadir 5 l de cultivo de una noche a los pocillos que contienen medio.
  6. Medir la curva de crecimiento (OD 600) y la fluorescencia de GFP (485 nm de excitación y de emisión de 520) usando un lector de placa de cada 10 minutos durante 18 horas a 37 ° C con agitación constante.
  7. Cálculo de la tasa de crecimiento y el contenido de GFP específica de las respectivas mediciones y comparar con el control. Calcular la media y la desviación estándar de al menos tres experimentos independientes.

7. Ensayo Tolerancia

  1. CulturaE. coli que expresan genes PhPFDα y β ( BBa_K398406 ) durante la noche en 5 ml de medio LB y los antibióticos adecuados. E. coli que expresan LADA gen ( BBa_K398017 ) se utilizó como control negativo.
  2. Subculture 10 l de la noche a la mañana en consecuencia fresco 5 ml de LB (con antibióticos) y se incuba hasta que la turbidez celular alcanzó una densidad óptica de 0,3 a 0,4 a 600 nm.
  3. Diluir los cultivos con medio fresco hasta una OD 600 de 0,1 se alcanza.
  4. Cargar una placa de 96 pocillos con 180 l medio M9 que contiene los antibióticos apropiados y la concentración final adecuada del compuesto tóxico (por ejemplo, 0, 4, 8, 10% de n-hexano) por triplicado. Dado que el agua alcano-mezclas podría conducir a sistemas de dos fases es esencial tener controles apropiados en la placa (por ejemplo, dcepas ifferent y los experimentos en blanco respectivos).
  5. Añadir 20 l de la cultura (control) en los pocillos.
  6. Medir la concentración de biomasa (OD 600) usando un lector de placas cada 10 minutos durante 24 horas a 37 ° C con agitación constante.
  7. Calcular las tasas de crecimiento de las mediciones respectivas para las diferentes concentraciones de agente y comparar con el control negativo. Calcular la media y la desviación estándar de al menos tres carreras independientes.

8. Homólogo Mapping Interacción

  1. El HIM aplicación fue desarrollada para realizar consultas de proteínas en un servidor PostgreSQL ejecuta la base de datos STRING (gratuito para uso académico) 20. La interacción homólogo aplicación de mapeo identifica las proteínas que interactúan en el organismo huésped original utilizando la base de datos STRING. Las secuencias de los genes respectivos que interaccionan se utiliza en una búsqueda BLAST para encontrar genes homólogos en el organismo objetivo. Cytoscape 4 se utiliza para visualizar el resultado de la asignación. La herramienta de software HIM se puede descargar en: https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.
  2. Para realizar un mapeo, (1) introducir el ID BioBrick y la aplicación se descargará automáticamente los datos de la secuencia parcial del Registro de partes biológicas estándar de 9, o (2) Intro (pegar) la secuencia de datos de la aplicación.
  3. Utilizar el sitio web de base de datos STRING para encontrar el ID de proteína STRING para la secuencia de ácido amino entrado.
  4. Una proteína con alta homología se determina usando BLAST. Posteriormente, la aplicación enumera cada proteína de interacción conocida en el organismo fuente y búsquedas de homólogos en el organismo huésped (por ejemplo, E. coli).
  5. Exportar lista resultante interacción putativo de texto o Cytoscape.

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Resultados

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Conversión de alcanos

La actividad de los tres pasos de oxidación desde el alcano hasta el respectivo ácido graso se evaluó utilizando ensayos de células en reposo y mediciones de actividad enzimática. Los resultados se presentan siguiendo las reacciones de la vía (1) alcano hidroxilasa, (2) alcohol deshidrogenasa y (3) aldehído deshidrogenasa.
Para el primer paso, se construyeron diferentes plásmidos para alcanos de cadena media y larga. El plásmido

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Discusión

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El principio BioBrick se utiliza para construir un chasis para la degradación de alcanos y una prueba de principio para los componentes individuales de la caja de herramientas se obtuvo. Se proponen varios ensayos para medir la in vivo e in vitro de la actividad de enzimas de la ruta de degradación de alcanos. El trabajo presentado con éxito demuestra un número de métodos que pueden utilizarse para determinar la actividad enzimática y la expresión en el organismo huésped E. coli después de la ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los experimentos realizados en este video-artículo fueron desarrollados para la competición internacional Genetically Engineered Machine 9. Los autores desean agradecer a los miembros del equipo iGEM Lucas Bergwerff, Pieter van TM Boheemen, Cnossen Jelmer, Hugo F. Cueto Rojas y Ramón van der Valk para la asistencia en la investigación. Agradecemos Han de Winde, Stefan de Kok y Yıldırım Esengul útil para los debates y hosting esta investigación. Este trabajo fue apoyado por la TU Delft University Departamento de Biotecnología, el Laboratorio de Bioinformática Delft, TU Delft Departamento de Bionanoscience, Oil Sands Leadership Initiative (OSLI), Stud studentenuitzendbureau, la Iniciativa de Países Bajos Genómica, Centro Kluyver, Nederlandse Vereniging Biotechnologische (Stichting Biotecnología Nederland) , DSM, Geneart, Greiner Bio-One y Genencor.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
E. coli K12New England BiolabsC2523H
OctaneFluka74822
HexadecaneFluka52209
octanol-1Fluka95446
dodecanol-1Sigma-Aldrich126799
HexanoSigma-Aldrich296090
NADHSigma-AldrichN4505
FMNSigma-AldrichF2253
MgSO4J.T. Baker Casno7487 889
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
T4 ligasaNew England BiolabsM0202L
Cromatógrafo
Disruptor celularLA BiosystemsCD-019
EspectrofotómetroAmersham pharmaciaspec 2000
Lector de placasTecan Group Ltd.Incubadora Magellan v7.0
Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubBUniversidad Tecnológica de Delft en el departamento de Biotecnología o Registro de Partes BiológicasEstándarBBa_K398014Sistema de Alcano Hidroxilasa
Resistencia: Cloranfenicol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA Universidad Tecnológica de Delft en el departamento de Biotecnología o Registro de PartesBiológicas EstándarBBa_K398027ladA Generador de proteínas
Resistencia: Cloranfenicol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH Universidad Tecnológica de Delft en el departamento de Biotecnología o Registro de PartesBiológicas EstándarBBa_K398018Generador de ADH
Resistencia: Cloranfenicol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH Universidad Tecnológica de Delft en el departamento de Biotecnología o Registro de Partes Biológicas EstándarBBa_K398030ALDH generator
Resistencia: Chloramphenicol
BioBrickTM K398326: pCaiF Universidad Tecnológica de Delft en el departamento de Biotecnología o Registro de Partes Biológicas EstándarBBa_K398326pCaiF promotor
Resistencia: Chloramphenicol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401Universidad Tecnológica de Delft en el departamento de Biotecnología o Registro de Partes Biológicas EstándarBBa_K398331pCaiF dispositivo de medición
Resistencia: Cloranfenicol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα -BBa_J61107- Universidad Tecnológica de Delft en el departamento de Biotecnología o Registro de Partes Biológicas EstándarBBa_K398406Clúster de tolerancia a disolventes
Resistencia: Cloranfenicol
de gases

Referencias

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