Electricidad-libre, el ácido nucleico secuencial y aislamiento de las proteínas

Resumen

Una herramienta y química se describen para aislar secuencialmente ácidos nucleicos seguido de proteínas a partir de una muestra sin la necesidad de electricidad. La herramienta consta de un sorbente a cabo dentro de una pipeta de transferencia, mientras que las químicas de aislamiento se basa en los principios de extracción en fase sólida. Las macromoléculas aisladas pueden ser analizados mediante ensayos de inmuno-basados ​​y basado en la PCR.

Resumen

Patógenos tradicionales y emergentes, tales como Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC), Yersinia pestis, o enfermedades basadas en priones son de gran preocupación para los gobiernos, las industrias y los profesionales médicos en el mundo. Por ejemplo, EHECs, junto con Shigella, son responsables de la muerte de aproximadamente 325.000 niños cada año y son especialmente prevalentes en el mundo en desarrollo, donde el laboratorio basado en la identificación, común en los Estados Unidos, no está disponible ^1. El desarrollo y la distribución de bajo costo, basados ​​en el terreno, los puntos de atención de herramientas para ayudar en la rápida identificación y / o el diagnóstico de patógenos o marcadores de enfermedad podría alterar dramáticamente la progresión de la enfermedad y el pronóstico del paciente. Hemos desarrollado una herramienta para aislar ácidos nucleicos y proteínas de una muestra por extracción en fase sólida (SPE) sin electricidad o equipos relacionados con el laboratorio ^2. Las macromoléculas aisladas pueden ser utilizados para diagnósticoSIS ya sea en un laboratorio hacia adelante o utilizando sobre el terreno en el punto de atención plataformas. Es importante destacar que este método ofrece para la comparación directa de ácido nucleico y los datos de proteínas de una muestra de las Naciones Unidas-split, que ofrece una confianza a través de la corroboración de análisis genómico y proteómico.

Nuestra herramienta aislamiento utiliza el estándar de la industria en fase sólida para el aislamiento de ácidos nucleicos, la tecnología de pluma, que aísla los ácidos nucleicos a partir de una solución de sal caotrópica, usualmente isotiocianato de guanidina, a través de la unión a base de sílice partículas o los filtros ^3. Patentada CUBRC de la química en fase sólida de extracción se utiliza para purificar proteínas a partir de soluciones salinas caotrópicos, en este caso, a partir de los residuos o flujo pasante tras el aislamiento de ácidos nucleicos ^4.

Por embalaje bien caracterizado química en una pequeña plataforma, barato y sencillo, se han generado un sistema portátil de ácido nucleico y la extracción de proteína que puede realizarse bajo una variety de condiciones. Los ácidos nucleicos aislados son estables y pueden ser transportados a una posición donde la potencia se encuentra disponible para la amplificación por PCR, mientras que el contenido de proteína inmediatamente pueden ser analizados por mano u otros ensayos inmunológicos basados. La rápida identificación de marcadores de la enfermedad en el campo podría alterar significativamente los resultados del paciente, dirigiendo el curso de tratamiento adecuado en una etapa temprana de la progresión de la enfermedad. La herramienta y el método descrito son adecuadas para su uso con prácticamente cualquier agente infeccioso y ofrecen al usuario la redundancia de los análisis de tipo multi-macromolécula al mismo tiempo reducir su carga logística.

Protocolo

1. Muestra Lisis

1. Las muestras deben ser en forma líquida. Si la muestra es sólida, por ejemplo alimentos o en las heces, la muestra debe ser suspendido en un medio líquido como el agua o solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Mezclar 500 l de la muestra con 500 l de tiocianato de guanidina 6M (pH 6,5) en un tubo de 1,5 ml.
3. Presionar la bombilla de una pipeta de extracción, expulsando el aire ambiente.
4. Saque toda la muestra de 1 ml en la pipeta de la extracción, el material absorbente, permitiendo que la bombilla se expanda lentamente.
5. Invertir la herramienta de extracción de tal manera que las perlas sorbentes y drenaje de la muestra en el bulbo.
6. Moler los granos absorbentes con la muestra en la lámpara con cuidado de no expulsar a la muestra fuera de la pipeta de la extracción.

2. Extracción de ácidos nucleicos (Figura 1, panel A)

1. Invertir la pipeta extracción (abertura hacia abajo) y expulsar la muestra en el tubo original de 1,5 ml.
2. Tire de la totalidad 1 ml de muestra en la pipeta de la extracción, pasando sobre el sorbente, a una velocidad moderada, teniendo cuidado de mantener el sorbente en el cuello de la pipeta de extracción.
3. Expulsar a toda la muestra en el tubo de 1,5 ml presionando la bombilla.
4. Repetir los pasos 2.2 y 2.3, hacer pasar la muestra a través de los sorbentes cuatro veces más para un total de 5 pasadas.
5. Después del quinto pase sobre el sorbente, expulsar a toda la muestra de 1 ml en 4 ml de tampón de extracción de proteínas (en un tubo cónico de 15 ml), cerrar el tubo, y dejar de lado para su uso posterior.
6. Lavar los ácidos nucleicos aislados pasando 1 ml de etanol al 95% durante los sorbentes tres veces, volviendo el etanol para su tubo original al pasaje final.
7. Repita el paso 2.6 con un segundo de 1 ml, 95% de etanol de lavado.
8. Presione y suelte el bulbo durante 5 minutos, pasando el aire ambiente a lo largo de la pipeta de extracción para secar los ácidos nucleicos o lecho sorbente. Limpiar etanol residual de la punta de la pipeta u extraccióncantar una Kimwipe.
9. Recuperar los ácidos nucleicos haciendo pasar 250 l de 10 mM Tris (pH 6,8) durante los sorbentes cinco veces. El tampón Tris puede ser reemplazado por cualquier otra solución acuosa adecuada tal como PBS. La solución resultante contiene los ácidos nucleicos extraídos.

3. La extracción de proteínas (Figura 1, panel B)

1. Mezclar la muestra y el tubo de extracción de proteínas de la etapa tampón 2,5 por inversión y pasar aproximadamente dos a tres mililitros de esta muestra de 5 ml más de la sorbente de una pipeta de extracción nuevo.
2. Expulsar toda la muestra en el mismo tubo de 15 ml cónico teniendo cuidado de mantener el sorbente en el cuello de la pipeta de extracción.
3. Repetir los pasos 3.1 y 3.2, hacer pasar la muestra a través de los sorbentes 15 veces.
4. Lavar el sorbente y la proteína unida al pasar a 1 ml de etanol al 95% sobre el lecho sorbente tres veces, expulsando el etanol en su tubo original.
5. Repita el paso 3.4 con un segundo de 1 ml, 95% de etanol de lavado.
6. Presione y suelte el bulbo durante 5 minutos, pasando el aire ambiente a lo largo de la pipeta para secar la extracción de proteína / cama sorbente. Limpiar etanol residual de la punta de la pipeta extracción utilizando un Kimwipe.
7. Recuperar la proteína haciendo pasar 250 l de PBS sobre el sorbente cinco veces. El tampón PBS se puede sustituir por cualquier otra solución acuosa adecuada tal como Tris 10 mM (pH 6,8). La solución resultante contiene el contenido en proteínas de la muestra.

Figura 1.

Figura 2.

Figura 3.

Figura 4.

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Figura 5.

Resultados

Aislamiento de ácidos nucleicos: los ácidos nucleicos son aislados PCR amplificable y libre de contaminación de proteínas.

Ejemplo 1: Los ácidos nucleicos recuperados son adecuados para uso en aplicaciones basadas en la PCR. Por ejemplo, la Figura 2 muestra la amplificación de genes de la toxina shiga asociados con enterohemorrágica E. coli O157: H7 EDL-933 (ATCC # 35150) a partir de un procedimiento de extracción de ácido nucleico / proteína con la pipeta de extracción. Los genes de la toxina shiga stx 1 y stx 2 se encuentran en templado lambda bacteriófago como bacteriófago defectuoso y en ésta y otras enterohemorrágica E. cepas de E. bajo el control del promotor P _R ^{5 6 7 8.} La activación de la respuesta SOS en E. E. conduce a profago inducción y / o producción de toxinas ^9. Hemos utilizado una versión modificada del ensayo de PCR multiplexada por Feng et al. ¹1 para identificar el stx 1 y genes stx 2, tanto en la cultura y muestras adicionadas de aguas residuales. Los carriles A y B en la Figura 2 se muestran los resultados de una amplificación por PCR de una muestra de cultivo sin procesar (carril A) y una muestra de cultivo procesado (carril B). Estos resultados son prácticamente idénticos significado que no hay pérdida de fidelidad en los ácidos nucleicos transformados o aisladas. A continuación amplificada de aguas residuales crudas de pinchos (calle D) o ácidos nucleicos aislados de las aguas residuales de pinchos (calles E y F). Estos datos indican que los ácidos nucleicos aislados como resultado una mayor amplificación frente a los ácidos nucleicos no aisladas a partir de muestras de aguas residuales con púas. Por consiguiente, concluimos que, o bien inhibidores de la PCR se encuentran naturalmente en las aguas residuales fueron eliminados en forma aislada o que los ácidos nucleicos se concentraron en el aislamiento. Una combinación de estas dos hipótesis es también posible.

Espectroscopia ultravioleta se utilizó junto a mostrar que los ácidos nucleicos aislados eran relativamente libre of proteína contaminante. Figura 3 muestra los espectros UV de dos E. coli O157: H7 extracciones de ácidos nucleicos, el aislamiento denominados A y B de aislamiento, en comparación con el espectro normalizado del cultivo bacteriano, etiquetado de pre-aislamiento. Los espectros UV de los ácidos nucleicos aislados se asemeja a los espectros de puros ácidos nucleicos, que tiene una relación calculada de absorbancia entre 260 nm y 280 nm se aproximan 1,8 ^10. Estos datos muestran que hay muy poca proteína contaminante en la fracción de ácido nucleico recuperado utilizando la técnica descrita.

Aislamiento de proteínas: proteína recuperada a partir del experimento de aislamiento de ácidos nucleicos / proteína es inmunorreactiva y electroforéticamente idéntica a la proteína pura.

Ejemplo 2: La fracción de proteína aislada se aplicó a la E. RapidChek coli O157 tiras laterales de flujo de ensayo (SDIX, Inc.). Los controles muestran una identificación positiva en todas las muestras que albergan E. E. O157, con o sin inducción STX (Figura 4, los carriles B y C, respectivamente). Los datos de la Figura 4 se muestran los resultados positivos de las muestras que albergan E. coli O157 que se procesaron para los ácidos nucleicos y proteínas a continuación, utilizando la pipeta de extracción. Estos datos muestran que la proteína aislada de cada muestra es inmunorreactiva desencadenando así una respuesta positiva.

Amplificación por PCR (como se describe en el Ejemplo 1) se realizó en las muestras de proteína para demostrar que la fracción de proteína aislada carecía de contaminar los ácidos nucleicos. Los resultados de estos experimentos fueron negativos por electroforesis en gel. Por lo tanto, se concluye que el contenido en proteínas de la muestra se separó de la contaminación de los ácidos nucleicos. Estos resultados, tomada en conjunto con los descritos para la demostración paso de ácido nucleico de aislamiento que los ácidos nucleicos y proteínas están aisladas en etapas de fraccionamiento separadas.

t "> Ejemplo 3:. La proteína aislada es adecuada para electroforesis ¹⁰ Figura 5 representa un teñido con Coomassie 8% en gel de acrilamida cargado con BSA (Figura 5, carriles A y C) y BSA aislado de isotiocianato de guanidina 6M utilizando la extracción pipeta y asociado protocolo. La movilidad electroforética de la proteína aislada es idéntica a la de las muestras de control. Por lo tanto la conclusión de que el proceso de extracción no altera la estructura covalente de la proteína aislada.

Figura 1, Panel A: Representación de un típico procedimiento de extracción de ácidos nucleicos La muestra se mezcla con tiocianato de guanidina 6M en el tubo de muestra y se pasa sobre el sorbente cinco veces.. Después de que el último paso, la muestra se añadió al tampón de extracción de proteínas. Los ácidos nucleicos y la envolvente sorbentes se lavan dos veces con etanol. La muestra es entonces aire dried y se eluyó desde el sorbente.

Figura 1, Panel B: Representación de un procedimiento de extracción de proteínas típica La muestra se mezcla con tampón proteína aislada de la etapa 1, la Figura 1, el panel A se pasa sobre el sorbente de una pipeta segunda extracción 15 veces.. El resto del procedimiento es idéntico al del protocolo de extracción de ácido nucleico.

Figura 2:. Imagen negativa de un bromuro de etidio en gel de agarosa teñido Un multiplexado Shiga gen de la toxina 1 y 2 experimento de amplificación se realizó utilizando muestras de cultivo (carriles A y B) o muestras de aguas residuales crudas enriquecidas con E. coli O157: H7 (calles D, E y F). Las muestras se añadió directamente a un tubo de reacción de PCR (carriles A y D) o las muestras fueron procesadas utilizando el proces aislamientos y los ácidos nucleicos extraídos se añadieron al tubo de reacción de PCR (muestras B, E y F). El protocolo de PCR es una modificación del descrito por Feng et al ^11. Nuestra modificación dirigida sólo a los amplificada por el stx 1 (banda inferior) y stx 2 (banda superior) pares de iniciadores, la deserción todas las parejas de cebadores otros. Carril C es la escalera 1Kb de BioRad.

Figura 3: Resultados de la espectroscopia UV de E. coli O157: H7 ácidos nucleicos aislados utilizando la pipeta extracción informó Los ácidos nucleicos aislados están etiquetados aislamiento ayb aislamiento.. El espectro UV de la muestra se ensayó también antes de la extracción de ácidos nucleicos y la etiqueta es de pre-aislamiento. Los espectros se obtuvieron utilizando un espectrofotómetro Hitachi U3010 y el paquete de software asociado.

Figura 4:. Foto color de las tiras de prueba RapidChek El contenido de proteína de las muestras utilizadas en la Figura 2 se aisló utilizando la pipeta de extracción y se ensayaron para la inmuno-reactividad mediante el ensayo de flujo lateral. Los carriles de CA son los controles sin procesar, es decir, se añadió el cultivo de células de la tira de prueba sin ácido nucleico o la extracción de proteínas. Línea A es E. coli BL21 DE3 pLysS como un control negativo, carriles B y C muestran E. coli O157: H7 que no fue tratada (B), o tratados con mitomicina C durante 4 horas (C). Los carriles D a H muestran los resultados de la adición de la proteína extraída de las tiras de prueba de flujo lateral. Los carriles D y E se probaron utilizando extracto de proteína de E. coli BL21 DE3 pLysS ya sea sin (D) o con mitomicina C tratamiento (E) como controles negativos. Los carriles AFP presentan los resultados cuando se extrae la proteína de E. coli O157: H7 fue utilizado. La proteína se extrae de no tratada (F), o de 2 horas (G) o 4 horas (H) mitomicina C cultivos tratados.Los resultados positivos producen una línea doble de color rojo.

Figura 5:. Fotografía de un teñido con Coomassie de SDS-PAGE de BSA se aisló de la solución con la pipeta extracción y protocolos descritos. Los carriles A y C son los carriles de control de 250 mg / ml y 500 mg / ml, respectivamente. Los carriles B y D representan BSA recuperado a partir de soluciones que contienen las mismas concentraciones que sus respectivos controles.

Discusión

Las herramientas, químicas y protocolo descrito en este informe representan el primer ejemplo conocido de un electricidad libre, sistema de extracción de múltiples macromolécula que se pueden utilizar en sobre el terreno, los puntos de atención aplicaciones. Ambos tipos macromolécula puede aplicarse a un número de dispositivos de diagnóstico o aguas abajo analítica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos aislados son de calidad de PCR (Figura 2 y 3) mientras que el componente de proteína de la muestra es inmunorreactiva (Figura 4). La utilización de este sistema de extracción en áreas limitadas austeros o de recursos de todo el mundo podría reducir drásticamente la carga de enfermedad en las poblaciones que viven allí. Este sistema de extracción también podría ayudar en los programas de vigilancia de enfermedades en todo el mundo, proporcionando un método eficaz robusta pero rápido y económico para el procesamiento de muestras en lugares austeros o remoto.

Un aspecto importante del método de extracción descrito anteriormente es quepuede ser modificado por el usuario. Por ejemplo, en casos donde el tamaño de la muestra es mayor o menor que los primeros 500 μLs (paso 1,2), el usuario puede ajustar el volumen de los reactivos en consecuencia. Esto es, la relación volumétrica de los reactivos al tamaño de la muestra debe permanecer constante mientras que los volúmenes absolutos pueden ser alterados. Además, los ajustes en el número de pasajes durante el sorbente se puede también hacer a discreción del usuario. Por ejemplo, si un volumen de muestra más grande se utiliza, hacer pasar la muestra a través de los tiempos sorbentes más que figuran (pasos 2.4 y 3.3) aumentará la probabilidad de que el tipo de macromolécula (ácido nucleico o proteína) poner en contacto el sorbente. El aumento de los pasajes debe incrementar la eficiencia de la captura hasta la saturación se alcanza absorbente.

Hemos encontrado que la herramienta de extracción y químicas asociadas tienen algunas limitaciones, la más importante de las cuales es que la química de extracción de proteínas es ineficaz para la recuperación de altamente glicosiladaproteínas. En el caso de que la corriente abajo de diagnóstico se dirige a una proteína glicosilada, este sistema puede no ser ideal para su identificación. Además, los límites superior e inferior de la eficiencia de extracción, ya sea para los ácidos nucleicos o las proteínas están aún por determinar, y la optimización está en marcha para maximizar la eficiencia de recuperación. Un mayor desarrollo de la herramienta va a superar estas lagunas en los conocimientos actuales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Tiocianato de guanidina	Teknova	G4000
etanol	Pharmco-Aaper	11ACS200
2-propanol	Sigma-Aldrich	109827-1L
BSA	Sigma	Una-4503