Un método de screening para la evolución dirigida de enzimas termoestables bacteriolítica

Summary

Un nuevo método de evolución dirigida específicamente al ámbito de la ingeniería termoestabilidad fue desarrollado y validado tanto para las enzimas bacteriolíticas. Después de sólo una ronda de mutagénesis al azar, una enzima bacteriolítica evolucionado, PlyC 29C3, muestra mayor que el doble de la actividad residual en comparación con la proteína de tipo salvaje después de incubación a temperatura elevada.

Abstract

Evolución dirigida se define como un método para aprovechar la selección natural con el fin de diseñar proteínas de adquirir propiedades particulares que no están asociados con la proteína en la naturaleza. La literatura ha proporcionado numerosos ejemplos sobre la aplicación de la evolución dirigida a alterar con éxito especificidad molecular y catálisis ^1. La principal ventaja de la utilización de la evolución dirigida en lugar de más racional enfoques para la ingeniería molecular se refiere al volumen y la diversidad de las variantes que pueden ser seleccionados ^2. Una posible aplicación de la evolución dirigida consiste en la mejora de la estabilidad estructural de las enzimas bacteriolíticas, tales como endolisinas. Bacteriófago codificar y expresar endolisinas para hidrolizar un enlace covalente crítico en el peptidoglicano (es decir, la pared celular) de las bacterias, lo que resulta en la lisis de la célula huésped y la liberación de los viriones progenie. En particular, estas enzimas tienen la capacidad de inducir la lisis extrínsecamente a Susceptbacterias ible en la ausencia de fagos y, además, se han validado tanto in vitro como in vivo por su potencial terapéutico ^3-5. El tema de nuestro estudio evolución dirigida implica la PlyC endolisina, que se compone de subunidades PlyCA y PlyCB ^6. Cuando se purificó y se añadió extrínsecamente, la holoenzima PlyC lisa los estreptococos del grupo A (GAS), así como otros grupos de estreptococos en cuestión de segundos y, además, ha sido validado in vivo contra GAS ^7. Significativamente, el seguimiento cinética de enzimas residuales después de incubación a temperatura elevada proporciona evidencia clara de que PlyC pierde actividad lítica abruptamente a 45 ° C, lo que sugiere una vida media corta terapéutico, lo que puede limitar el desarrollo adicional de esta enzima. Otros estudios revelan la falta de estabilidad térmica se observa solamente para la subunidad PlyCA, mientras que la subunidad PlyCB es estable hasta ~ 90 ° C (observación no publicada). Además de PlyC, hay sarias ejemplos en la literatura que describen la naturaleza termolábil de endolisinas. Por ejemplo, el Staphylococcus aureus endolisina LysK y Streptococcus pneumoniae endolisinas Cpl-1 y Pal perder actividad espontáneamente a 42 ° C, 43,5 ° C y 50,2 ° C, respectivamente ^8-10. De acuerdo con la ecuación de Arrhenius, que relaciona la velocidad de una reacción química a la temperatura presente en el sistema en particular, un aumento en la termoestabilidad se correlacionan con un aumento de la esperanza de vida de estante ^11. Con este fin, la evolución dirigida ha demostrado ser una herramienta útil para alterar la actividad térmica de varias moléculas en la naturaleza, pero nunca ha esta tecnología particular ha explotado con éxito para el estudio de las enzimas bacteriolíticas. Asimismo, las cuentas de éxito para progresar en la estabilidad estructural de esta clase particular de los antimicrobianos en conjunto son inexistentes. En este vídeo, se emplea una metodología novedosa que utiliza un error-pruna polimerasa de ADN seguido por un proceso de selección optimizada utilizando un formato de 96 pocillos placa de microtitulación para identificar las mutaciones de la subunidad PlyCA de la PlyC endolisina estreptocócica que se correlacionan con un aumento de la estabilidad cinética enzimática (Figura 1). Los resultados después de sólo una ronda de mutagénesis al azar sugieren la metodología es la generación de variantes PlyC que retienen más del doble de la actividad residual en comparación con los de tipo salvaje (WT) PlyC después de tratamiento a temperatura elevada.

Protocol

1. Determinar las condiciones óptimas de calefacción

Primero, uno debe determinar experimentalmente la temperatura de incubación y tiempo óptimos a usar para la etapa de calentamiento en el ensayo. Para nuestro modelo PlyC, es importante notar que E. co-coli transformadas con genes plyCA y plyCB en plásmidos de expresión independientes ha mostrado para formar una holoenzima PlyC completamente funcional ^6. La preparación de 96 pocillos de microtitulación así como las condiciones de crecimiento celular y la técnica de réplica en placas posteriores fueron adaptados a partir de ejemplos proporcionados en la literatura ^12-16. Un tiempo de incubación de 30 min será adecuado para este ensayo como resultados de los anteriores experimentos de inactivación térmica dictar una rápida pérdida de actividad durante el breve período de incubación en ambientes superiores a la temperatura fisiológica (observación no publicada). La temperatura de incubación óptima para PlyC fue aclarada por los siguientes pasos:

1. Transform la construcción de expresión pBAD24: plyCA (Amp ^r) en el competente E. coli cepa DH5a pBAD33: plyCB (Cm ^r).
2. Placa de los transformantes sobre una placa de agar Luria-Bertani (LB) suplementado con ampicilina (100 mg / ml) y cloranfenicol (35 mg / ml). Se incuban las placas durante la noche a 37 ° C.
3. Con un palillo de dientes estéril, inocular una colonia individual en cada fila de pocillos (Figura 2a) en una solución estéril, transparente, de fondo plano de 96 pocillos, con tapa de placa de microtitulación que contiene 200 l de LB suplementado con ampicilina y cloranfenicol.
4. Segura colocar la placa de microtitulación de 96 pocillos en un 37 ° C incubadora de agitación y crecer las bacterias durante la noche a 300 rpm.
5. Recuperar la placa de microtitulación de 96 pocillos de los 37 ° C incubadora de agitación y la placa de réplica a una nueva placa de 96 pocillos de microvaloración de la siguiente manera:
   1. Añadir 180 l de LB suplementado con ampicilina y cloranfenicola cada pocillo de la placa de réplica.
   2. Transferir 20 l de bacterias de la placa original a los pocillos correspondientes en la placa de réplica. Esto debe resultar en un ₆₀₀ OD inicial de ~ 0,5.
6. Segura coloque la placa réplica en los 37 ° C incubadora de agitación e incubar la placa durante 1 hora a 300 rpm, a continuación, añadir el inductant. En el caso de los sistemas de expresión pBAD, la inductant es 0,25% de arabinosa. Otros sistemas de expresión puede requerir inductants diferentes. Coloque la placa posterior de la 37 ° C incubadora de agitación y se agita a 300 rpm durante un adicional de 4 horas para permitir la expresión de la proteína. Los niveles de expresión suelen oscilar entre 10-20 g de PlyC.
7. Una vez que ha concluido la expresión de proteínas, recuperar la placa de réplica y sedimentar las bacterias mediante la colocación de la placa de microtitulación de 96 pocillos en una centrífuga refrigerada que contiene un rotor oscilante-cubo que se adapte a placas de microtitulación de 96 pocillos. Centrifugar a 3.000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente.
8. Eliminar el sobrenadante por medios lentamente invirtiendo la placa de microtitulación y suavemente decantación de los medios.
9. Lisar las células mediante la adición de 50 l de B-PER II bacteriana del reactivo de extracción de proteína a cada pocillo. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 20 min.
10. Aumentar el volumen en cada pocillo a 120 l mediante la adición de 70 l de tampón fosfato salino (PBS) pH 7,2.
11. Agregar el debris celular insoluble por centrifugación de la placa a 3.000 rpm durante 10 min a 4 ° C en la centrífuga refrigerada.
12. Transferir 110 l de lisado crudo soluble a los correspondientes pocillos de una placa de termociclador de 96 pocillos.
13. Uso de 30 min como el tiempo de incubación predeterminado, exponer los lisados ​​solubles que residen actualmente en la placa de termociclador de 96 pocillos a una amplia gama que abarca gradiente de temperatura 15-20 ° C. Tenga en cuenta, el objetivo es determinar a qué temperatura de una enzima particular pierde> 95% de la actividad catalítica.
14. Después de la incubación, la incubación de 96 pocillosplaca de termociclador a 4 ° C durante 5 min y transferir 100 l de los lisados ​​solubles de la placa de termociclador de 96 pocillos a su localización correspondiente bien en la final de 96 pocillos placa de microtitulación.
15. Con un multipipettor 12-canales, añadir 100 ml de la cepa de GAS D471 a cada pocillo. Nota, D471 células son originalmente liofilizó a partir de cultivos de una noche y se resuspendieron con PBS pH 7,2 para obtener una OD ₆₀₀ de ~ 2,0.
16. Inmediatamente se coloca la placa de 96 pocillos en el espectrofotómetro de microplacas y controlar la cinética enzimática midiendo la OD ₆₀₀ cada 15 segundos durante 20 min. La incubación temperatura más baja que correspondía a pozos que carecían de un cambio en la densidad óptica (ΔOD ≤ 0,1) se define como la temperatura no permisiva.

Después de una pantalla de temperatura amplio se realiza para identificar la temperatura no permisiva, los pasos anteriores pueden ser repetidos en un rango más estrecho de temperaturas (5 ° -10 ° C) para elucidarla precisa temperatura no tolerable para la enzima de interés. Nota, la temperatura no permisiva identificado en este ensayo puede ser diferente de la temperatura de fusión dilucidado por otros medios debido a diferencias en el volumen, concentración, etc

2. Generación de la biblioteca de mutantes

La creación de la biblioteca de mutantes que se proyectarán implica la incorporación de mutaciones al azar por una polimerasa de DNA propensa a errores con un sesgo mínimo de nucleótidos en el gen plyCA usando el kit de mutagénesis aleatoria GeneMorph II como sigue:

1. Diseñar cebadores de nucleótidos con temperaturas de fusión similares (T _m) entre 55-72 ° C con los sitios de restricción de elección en el extremo 5 'y 3' del gen plyCA.
2. Dado que la tasa de mutación deseada es de 2-3 nucleótidos por plyCA (1,4 kb), el uso de las concentraciones de los componentes de reacción de PCR así como las condiciones del termociclador recomendadas por el fabricante para f mutaciones bajarequencies (0-4,5 por kb).
3. Clonar los genes mutados plyCA en el vector de expresión pBAD24.
4. Transformar los constructos en un DH5a pBAD33: fondo plyCB y los transformantes de placas en placas de agar LB suplementado con ampicilina y cloranfenicol.
5. Además, transformación y placa DH5a pBAD33: plyCB con el vector de expresión que contiene el gen pBAD24 PESO plyCA. Las colonias de esta placa servirán como los controles efectuados durante la proyección.

3. Microtitulación de 96 pocillos placa de Preparación y Condiciones de Crecimiento Celular

1. Llenar cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos con 200 l de LB suplementado con ampicilina y cloranfenicol.
2. Siguiendo el esquema de placa de microtitulación (figura 2b), seleccionar cuidadosamente una colonia individual de las placas de agar durante la noche con un palillo de dientes esterilizado e inocular las bacterias en el designado bien de la 96 pla bien microtitulaciónTE. Es esencial para garantizar que sólo una colonia por pocillo se inocula.
3. Agitar la placa firmemente anclado 96 pocillo de microtitulación a 300 rpm durante la noche a 37 ° C.

4. Revestimiento de la reproducción, inducción de la expresión de proteínas y preparación Lysate

1. Siga los pasos 1.5-1.11 de la sección titulada "Determinación de las condiciones óptimas de calentamiento" con una modificación. La tienda de la placa original a 4 º C después de la etapa de réplica en placas ha concluido.
2. Después del paso 1,11, la transferencia de 110 l de lisado crudo soluble a los correspondientes pocillos de una placa de termociclador de 96 pocillos, excepto para el control positivo los pocillos A1-D1. Con respecto a los lisados ​​de control positivo (es decir, que no lisados ​​se calienta), la transferencia de 100 l de los lisados ​​a los pocillos correspondientes en una nueva placa de 96 pocillos de microvaloración que servirá como la placa final de ensayo para el experimento y se almacena en hielo.

5. El tratamiento térmico Soluble Lysate

1. Calentar el control negativo y soluble mutante lisados ​​limita en la actualidad en la placa de termociclador de 96 pocillos en el termociclador durante 30 min a la temperatura de incubación optimizado no permisiva determinado en el paso 1.
2. Después de incubación a temperatura no permisiva, se incuba la placa 96 termociclador bien a 4 ° C durante 5 min.
3. Transferir 100 l de los lisados ​​solubles de la placa de termociclador de 96 pocillos a sus ubicaciones idénticas así en la última placa de 96 pocillos ensayo de microtitulación que contiene ya los lisados ​​de control solubles positivos.
4. Con un multipipettor 12-canales, añadir 100 ml de la cepa de GAS D471 a cada pocillo. Inmediatamente se coloca la placa en el espectrofotómetro de microplacas.
5. Monitorear la cinética enzimática midiendo la OD ₆₀₀ cada 15 seg durante 20 min.
   1. Una variante PlyC con comportamiento progresado térmica se define como una construcción que puede disminuir la densidad óptica original en un 50 por ciento en menos de 900 segundos a latemperatura no tolerable. Además, los controles positivos (es decir, no calentado, WT PlyC) necesita mostrar actividad catalítica WT (t _1/2 ≤ 100 seg) y los controles negativos (es decir, calentado, WT PlyC) debe ser desprovisto de actividad.
6. Una vez que una variante PlyC con progresado comportamiento térmico se identifica, recuperar la placa original almacenado a 4 ° C y se inoculan bacterias de la persona bien específico para el mutante de interés en medio LB fresco suplementado con ampicilina y cloranfenicol. Crece el inóculo durante la noche a 37 ° C.
7. Extraer y purificar ADN plasmídico a partir del cultivo y luego someter a secuenciación para identificar las mutaciones de nucleótidos que inferir el comportamiento térmico mejorado para PlyCA. Adicionalmente, suplementar una pequeña alícuota del cultivo durante la noche con 10% de glicerol y se almacena a -80 ° C para su uso posterior.

Results

Al término de la primera ronda de mutagénesis aleatoria, más de 6.000 mutantes PlyC fueron seleccionados y un total de 35 mutantes con comportamientos potencialmente aumentado térmico fueron identificados, seleccionados y secuenciados. El análisis genómico, que se resumen en la Tabla I, indica que de los 35 candidatos, 7 de las construcciones contenidas WT secuencias PlyCA a nivel de traducción, correspondiente a los falsos positivos identificados por el ensayo. De los restantes 28 candidatos, el rango de mutación fue de 1 a 6 mutaciones de nucleótidos con una tasa de mutación promedio de 2,75 nucleótidos por plyCA gen, que estaba en el intervalo 2-3 mutación de nucleótidos que se ha orientado. A nivel de traducción, esta gama particular de mutación de nucleótidos y la frecuencia se obtuvo un rango ácido amino mutación de 1 a 5 aminoácidos, con una tasa de mutación promedio de 1,9 mutaciones de aminoácidos por PlyCA polipéptido.

De los 28 candidatos con al menos un aminoácido Mutation, cuatro de estos constructos mutantes fueron elegidos al azar para una caracterización adicional para validar que el proceso de revisión exhaustiva de la metodología de evolución dirigida fue de hecho funcionando correctamente. Las enzimas PlyC mutantes se purificaron a homogeneidad> 95% basado en el análisis de SDS-PAGE como se ha descrito previamente ^6-7. Cinética enzimática de WT PlyC y cada uno de los cuatro mutantes PlyC se caracterizaron en concentraciones molares iguales después de incubar las enzimas purificadas a diversas temperaturas elevadas. Actividad se controló después de la adición de D471 GAS midiendo la densidad óptica a 600 nm cada 15 segundos durante 20 min. La actividad se define como la velocidad máxima de la enzima residual después de la incubación de calor. De los cuatro candidatos seleccionados al azar para la caracterización adicional, 29C3 mutante mostró el comportamiento térmico más mejorada. El comportamiento térmico de WT PlyC y 29C3 se investigó a diferentes temperaturas, mientras que la incubación y el ensayo de la actividad en PBS pH 7,2 a80 nM y 40 nM concentraciones, respectivamente. Los 45-50 ° C experimentos de incubación (Figura 3) se realizó en un termociclador donde las muestras se incubaron en una pared delgada placa de termociclador 96 pocillos en un volumen total de 120 l. El 35 ° C, 40 ° C y 45 ° C experimentos de incubación (Figura 4 y 5) se realizaron en un bloque de calor donde las muestras se incubaron en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en un volumen total de 1,3 ml. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

PESO PlyC y 29C3 no mostró ninguna diferencia significativa en la estabilidad cinética a temperatura ambiente (25 ° C) como se muestra en el primer conjunto de barras de la Figura 3. Sin embargo, después de una incubación a corto plazo de 30 min de temperaturas que oscilan entre 45-50 ° C, la actividad de 29C3 era sustancialmente mayor que la actividad específica para el WT construir en cada punto de temperatura. Por ejemplo, WT PlyC muestra una pérdida de 44% de la actividad a 45,2° C mientras que 29C3 mostró sólo una pérdida de 2% en la actividad a la misma temperatura.

Estudios a largo plazo de incubación que comparan la actividad residual de ambos WT PlyC y 29C3 se realizaron adicionalmente a 35 ° C y 40 ° C que implica la medición de la actividad residual a las 24 y 48 puntos de tiempo hr. A 35 ° C, 29C3 muestra 41% y la actividad 176% mayor que WT PlyC a 24 y 48 hr puntos de tiempo de incubación, respectivamente (Figura 4a). A 40 º C, 29C3 muestra 28% y la actividad 107% mayor que WT PlyC a 24 y 48 hr puntos de tiempo de incubación, respectivamente (Figura 4b).

La actividad residual de WT PlyC y 29C3 también se controlaron cada 20 minutos durante un total de 3 horas a 45 ° C. PESO PlyC sólo fue capaz de retener 21% de actividad después de una incubación de 3 horas a esta temperatura mientras que 29C3 fue capaz de retener 46% de actividad. La vida media (t _1/2) para WT PlyC y 29C3 eran 67 y 147 min, respectivamente, sugieren ING 29C3 que tiene un aumento de 2,2 veces en la estabilidad cinética a 45 ° C (Figura 5).

Total de la Ronda 1 Candidatos	35
Los candidatos con el tiempo de secuencia PlyCA	7
Los candidatos con ≥ 1 mutación de aminoácido	28
- Tarifa media mutación de nucleótidos (nt / plyCA)	2,75
- Rango de mutación de nucleótidos (nt)	1-6
- Media aminoácidos tasa de mutación (AA / PlyCA)	1,9
- Gama Amino Acid Mutación (AA)	1-5

Tabla 1. Análisis genómico de candidatos.

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Figura 1. Metodología dirigida ensayo de evolución. En la evolución dirigida, se comienza con la enzima de plomo, lo que sería PlyC WT para la primera ronda. Una biblioteca de mutantes PlyC que contienen mutaciones aleatorias de nucleótidos recomendaciones para el gen plyCA continuación, se construye por una polimerasa de DNA propensa a errores, se clonó en el vector de expresión pBAD24 y se transforma en la E. coli cepa DH5a que ya contiene pBAD33:. plyCB transformantes individuales se inocularon en su propio específico pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos. A través de un proceso de selección extensa, mutantes individuales PlyC que son catalíticamente activo tras la incubación a una temperatura no permisible se clasifican como mutantes con estabilidad cinética mejorada. Theconstruct muestra el comportamiento más avanzado térmico por consiguiente se convierte en la enzima principal para la siguiente ronda de mutagénesis aleatoria. En general, hay tres rondas completas de random seguido por mutagénesis aleatoria de ADN que resulta en una molécula con bacteriolítica evolucionó el comportamiento térmico. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 2. 96 así plantillas de la placa de microtitulación para el ensayo de evolución dirigida. El esquemática placa de microtitulación durante la determinación de las condiciones de calentamiento óptimos (Figura 2a) consiste en la inoculación de un único clon parental PESO PlyC en cada fila de la placa de microtitulación. El esquema de placa de microtitulación durante el cribado mutante (Figura 2b) consiste en inocular cada pocillo en la columna 1 con un único clon parental PESO PlyC así como la inoculación de cada pocillo de las columnas 2-12 con un distinto clon mutante PlyC. Los pocillos A1-D1 se designan para los controles positivos parentales, que cooperanNSISTE de WT PlyC construcciones no expuesto a la temperatura de incubación no permisible. Wells E1-H1 se designan para los controles negativos parentales, que consisten en WT construcciones PlyC que están expuestos a la temperatura de incubación no permisible.

Figura 3. Análisis de la actividad cinética residual comparando PESO PlyC y 29C3. Las enzimas se purificaron hasta homogeneidad y se incubaron durante 30 min en un termociclador a concentraciones molares iguales a la temperatura ambiente ya sea o en un gradiente de temperatura que oscila entre 45-50 ° C. La actividad enzimática se correlaciona con la velocidad máxima aparece después de la incubación temperatura específica. Con la excepción de 25 ° C y 47,7 ° C, la variación en la actividad entre el TE y 29C3 a cada temperatura correlacionada con un valor de p <0,05. Todos los datos se presentan como la media ± SEM de tres experimentos independientes.

Figura 4. Análisis de la actividad cinética residual comparando PESO PlyC a 29C3 a 35 ° C y 40 ° C. concentraciones molares iguales de purificado PESO PlyC y 29C3 se incubaron en un bloque de calor a 35 ° C (Figura 4a) o 40 ° C (Figura 4b). La actividad enzimática residual se midió a 24 y 48 puntos de tiempo hr. La actividad desplegada por cada constructo se normalizó a la velocidad máxima se muestra en el tiempo cero punto. La variación en la actividad entre el TE y 29C3 en cada punto de temperatura y tiempo correlacionado con un valor de p <0,05. Todos los datos se presentan como la media ± SEM de tres experimentos independientes.

Figura 5. Análisis de la actividad cinética residual comparandoPESO PlyC a 29C3 a 45 ° C. concentraciones molares iguales de purificado PESO PlyC y 29C3 se incubaron en un bloque de calor a 45 ° C y la actividad enzimática residual se midió cada 20 min durante 3 horas. La actividad desplegada por cada constructo se normalizó a la velocidad máxima se muestra en el tiempo cero punto. Con la excepción de los puntos de datos en 20 min, la variación en la actividad entre el TE y 29C3 en cada punto de tiempo correlacionado con un valor de p <0,05. Todos los datos se presentan como la media ± SEM de tres experimentos independientes.

Discussion

Este protocolo, descrito en la Figura 1, se presenta una metodología bien 96 placa de microtitulación que permite utilizar evolución dirigida para aumentar la termoestabilidad de cualquier enzima bacteriolítica. Mediante el uso de una ADN polimerasa propensa a errores, se pueden introducir mutaciones al azar que aumentan la estabilidad general cinética de la molécula traducido bacteriolítica de interés, que es típicamente debido a las reorganizaciones molecular que consiste en aumentar electrostática, puente disulfuro y por interacciones hidrofóbicas que generan mejorado embalaje molecular, modificaciones mejoradas de las redes de carga superficial o refuerzo de un estado de oligomerización superior ^17-18. Después de la introducción de mutaciones de nucleótidos, un procedimiento de cribado extenso se utilizó a continuación para identificar las mutaciones que son térmicamente beneficioso. Los resultados representativos se presentan aquí se basan en una ronda de mutagénesis al azar. En realidad, se ha sugerido queal menos tres rondas sucesivas de mutagénesis aleatoria, cada uno usando el mutante más robusto como el enzima de plomo, seguido por combinación aleatoria de ADN es apropiado para este tipo de estudios dirigidos comportamiento evolución térmica ^2.

Es importante comprender que mientras que este protocolo identifica las mutaciones que aumentan la estabilidad cinética, estas variantes no necesariamente han aumentado termoestabilidad. Una molécula se considera termoestable cuando tiene la capacidad de conservar su estructura a una temperatura alta. Sin embargo, en el ensayo presentado, la actividad residual de los lisados ​​mutantes no se analizan a la misma temperatura que se incubaron inicialmente menos durante la etapa de tratamiento térmico y por lo tanto uno se puede seleccionar para las mutaciones que promueven el replegamiento en lugar de termoestabilidad mejorada ^19. Mientras que estamos extrapolando comportamiento térmico como una indicación de la estabilidad térmica, la estabilidad térmica verdadero debe ser medido empíricamente por biophyscos métodos tales como dicroísmo circular (CD), calorimetría diferencial de barrido (DSC) y fluorimetría de exploración diferencial (DSF). Los datos preliminares de experimentos de CD y DSF sugieren que varios candidatos identificados a partir de la metodología presentada en efecto, visualizar termoestabilidad progresado (datos no mostrados).

Aunque la metodología que se presenta aquí es específico para implementar el comportamiento térmico aumentado a PlyC, esta misma metodología, además, puede ser empleado para mejorar la actividad térmica a otras enzimas bacteriolíticas con algunas modificaciones menores de variables tales como tampones, las tasas de mutación, las condiciones de calentamiento y sistemas de expresión. Una variable fundamental asociado con este ensayo se refiere a la tasa de mutación de nucleótidos de la ADN polimerasa propensa a errores. Hemos elegido utilizar el error-prone Mutazyme ADN polimerasa II en nuestro ensayo de evolución dirigida, debido a la evidencia experimental que sugiere que esta enzima en particular muestra la menor cantidad de sesgo conse refiere a que los nucleótidos están aleatoriamente incorporará en el gen de interés en comparación con otras técnicas de mutagénesis al azar tales como el uso de hidroxilamina, mutator E. cepas de E. coli y otro ADN propenso a errores polyermases ^20. En general, la disminución de las tasas de mutación tienden a ser más deseable por dos razones. En primer lugar, la termoestabilidad de ingeniería a las proteínas típicamente consiste en sustituciones de aminoácidos relativamente pocos aminoácidos. Las altas tasas de mutación puede provocar dramáticas alteraciones estructurales de moléculas particulares que definitivamente puede resultar en mal plegamiento estructural y las discrepancias funcionales. Por ejemplo, la incorporación de residuos de prolina y glicina pueden interrumpir alfa estructuras secundarias helicoidales ^21. Segundo, las tasas altas de mutación de nucleótidos aumentar las posibilidades de incorporación de codones de parada prematuros, lo que resulta en moléculas truncadas que son biológicamente inactivos. En general, la disminución de las tasas de mutación son preferidos debido a las tasas de error más baja en el resultado accumulción de mutaciones de adaptación mientras que los altos índices de mutación generar mutaciones neutrales o nocivas ^22.

Para cada ronda de mutagénesis al azar, otra variable crítica que se debe optimizar la temperatura de incubación implica utilizado durante el proceso de selección. Selección de la experimental no permisiva temperatura es relativamente difícil. Inicialmente se utiliza una temperatura de incubación que era 10 ° C más alta que la temperatura no permisiva de PlyC, sin embargo después de filtrar las 3.000 mutantes, no hemos podido identificar cualquier mutaciones ventajosas. Teniendo en cuenta la evolución dirigidas metodologías consisten en identificar secuencialmente beneficiosos sustituciones de aminoácidos que tienen efectos aditivos, se determinó que una temperatura menos rigurosas debe utilizarse durante el proceso de selección, aún si no aumentó la posibilidad de generar falsos positivos. Como tal, se utilizó una temperatura de incubación que era sólo unos pocos grados por encima de la no-permissive temperatura y volvieron a seleccionar los candidatos seleccionados para descartar los falsos positivos.

Decidimos utilizar una temperatura de incubación que no era demasiado templado (≤ 1 ° C más alta que la más baja temperatura no tolerable) y por el contrario no dura demasiado (≥ 5 ° C más alta que la más baja temperatura no permisiva). La temperatura ideal se decidió utilizar en este ensayo particular era un moderado 2 ° C más alta que la determinada experimentalmente temperatura no tolerable. Elegir una temperatura que es demasiado suave dará lugar a una mucho mayor tasa de falsos identificación positiva que el ~ 20% se observó (Tabla I) cuando se utiliza una temperatura de incubación moderada. Además, utilizando una temperatura de incubación que es demasiado duro podría resultar en la imposibilidad de identificar mutantes con comportamiento térmico mejorado de manera significativa. Por ejemplo, utilizando una temperatura de incubación de ≥ 5 ° C habría dado lugar a la incapacidad de identificar laprometiendo mutante 29C3, así como la mayoría de los otros candidatos seleccionados en la primera ronda de selección.

En resumen, se proporciona un protocolo para la ingeniería de enzimas bacteriolíticas para adquirir estabilidad cinética mejorada. Por otra parte, este mismo ensayo, sin los pasos de calentamiento, se puede utilizar para la detección de mutaciones que aumentan la actividad catalítica. Aumentar tanto la actividad catalítica y la estabilidad térmica es un obstáculo importante en el desarrollo frente a cualquier enzima terapéutica. Aunque los detalles de este protocolo son específicos de la PlyC endolisina, la metodología se puede adaptar a cualquier enzima bacteriolítica con sólo unas pocas modificaciones. Se presentaron los resultados preliminares a partir de sólo la primera ronda de mutagénesis que valida que la funcionalidad del ensayo, lo que resulta en la aplicación y la identificación de mutaciones que generan un aumento de la termoestabilidad molecular de magnitud significativa.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
B-PER II proteína bacteriana reactivo de extracción	Thermo Scientific	78260
GeneMorph II Kit de mutagénesis aleatoria	Agilent Technologies	200500
Borrar de 96 pocillos de fondo plano placa de microtitulación con tapa	BD Vacutainer Labware Médico	353072
96 Bueno Nonskirted placas PCR	Fisher Scientific	14-230-232
Rotor basculante	Eppendorf	A-2-DWP
Ampicilina sal sódica	Fisher Scientific	BP1760
El cloranfenicol	Fisher Scientific	BP904
Arabinosa	Fisher Scientific	BP2504
Vector de expresión pBAD24	ATCC	87399
Vector de expresión pBAD33	ATCC	87402