La biosíntesis de la matriz extracelular cartilaginosa por los condrocitos pueden ser afectados por la aplicación de estímulos mecánicos. Este método describe la técnica de aplicación de dinámicas tensiones compresivas a los condrocitos encapsulados en construcciones en 3D y la evaluación de los cambios inducidos en el metabolismo de los condrocitos.
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Artículo de método
La estimulación mecánica de condrocitos-agarosa hidrogeles
En este artículo
Resumen
Resumen
El cartílago articular sufre de una capacidad limitada de reparación deteriorados por el insulto mecánico o degradados por la enfermedad, tal como la osteoartritis. Para remediar esta deficiencia, varias intervenciones médicas se han desarrollado. Uno de tales métodos es para recubrir la zona dañada con cartílago de tejido de ingeniería, sin embargo, la ingeniería de tejidos típicamente carece de las propiedades bioquímicas y la durabilidad de cartílago nativo, cuestionando su supervivencia a largo plazo. Esto limita la aplicación de la ingeniería de tejido cartilaginoso a la reparación de pequeños defectos focales, basándose en el tejido circundante para proteger el material implantado. Para mejorar las propiedades del tejido desarrollado, la estimulación mecánica es un método popular utilizado para mejorar la síntesis de la matriz extracelular cartilaginosa, así como las propiedades mecánicas resultantes de la ingeniería tisular. La estimulación mecánica se aplica fuerzas al tejido construye análoga a las experimentadas in vivo. Estase basa en la premisa de que el entorno mecánico, en parte, regula el desarrollo y mantenimiento de 1,2 tejido nativo. La forma más comúnmente aplicado de la estimulación mecánica en la ingeniería de tejido de cartílago es la compresión dinámica a cepas fisiológicos de aproximadamente 5-20% a una frecuencia de 1 Hz a 1,3. Varios estudios han investigado los efectos de la compresión dinámica y han demostrado que tienen un efecto positivo sobre el metabolismo de los condrocitos y la biosíntesis, en última instancia, afectar a las propiedades funcionales del tejido 4-8 desarrollado. En este trabajo, se expone el método para estimular mecánicamente condrocitos agarosa construcciones de hidrogel bajo compresión dinámica y analizar los cambios en la biosíntesis a través de ensayos bioquímicos y radioisótopos. Este método también puede ser fácilmente modificado para evaluar cualquier cambio potencialmente inducidos en respuesta celular como resultado de estímulos mecánicos.
Protocolo
1. Aislamiento de condrocitos articulares primarios
Cosecha 10-15 rebanadas completo de cartílago de espesor de las superficies articulares de las articulaciones de animales (por ejemplo, la articulación metacarpiana-falángica de vacas esqueléticamente maduros obtenidos de un matadero local).
- Colocar las rodajas de cartílago en un 100 mm placa de Petri y se incuba en 20 ml de 0,5% de proteasa en Ham F-12 (w / v) durante 2 horas a 37 ° C. Enjuague tres veces en medios de cultivo de Ham F-12, y se incuba con 20 ml de 0,15% de colagenasa A en los medios de cultivo de Ham F-12 durante la noche a 37 ° C.
- Se filtra la suspensión celular a través de un filtro de malla 200 de pantalla en un plato limpio. Lavar el filtro con 5 ml de Ham F-12 y añadir al plato. Transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 50 ml. Lavar la placa de Petri con 10 ml de Ham F-12 y añadir al tubo cónico.
- Centrifugar el tubo a 600-800 rcf durante 6-8 min a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y asegúrese de no molestar ªe pastilla de células y volver a suspender en 40 ml de medio de cultivo de Ham F-12.
- Centrifugar el tubo a 600-800 rcf durante 6-8 min.
- Repetir los pasos 1,4 y 1,5 veces más para un total de 3 veces. Antes de la centrifugación de la tercera vez, resuspender el precipitado a través de la agitación y obtener una alícuota de 500 l para el recuento celular.
- Contar las células viables usando el método de exclusión con azul de tripano 9 con un hemocitómetro y un microscopio de luz invertida.
- Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en un volumen de 12-F de Ham al doble de la densidad de siembra deseada (por ejemplo 20 x 10 6 células / ml para una concentración final de 10 x 10 6 células / ml después de la encapsulación).
2. Condrocito-agarosa hidrogel Encapsulación
- Calor 0,8 g autoclave Tipo VII de agarosa en 20 ml de PBS 1x estéril (pH 7,4) en una placa caliente ajustada a 120 ° C hasta que se disolvió. Una vez disuelto, reducir el calor a 60 ° C como temperaturas más altas will afectar la viabilidad celular.
- En un tubo cónico de 50 ml, mezclar cuidadosamente volúmenes iguales de la suspensión celular con el doble de la concentración deseada de agarosa (por ejemplo, 4% de suspensión de agarosa para una final de 2% de hidrogel de agarosa). Evitar la creación de burbujas grandes, ya que pueden afectar a la viabilidad celular y la construcción de la vida de fatiga.
- Cuidadosamente alícuota de 10 ml de la mezcla de condrocito-agarosa en un diámetro de 60 mm placa de Petri, evitando al mismo tiempo la creación de burbujas grandes.
- Dejar reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente hasta que gelificó.
- Obtener el mayor número de condrocitos-agarosa muestras de hidrogel, según sea necesario (típicamente 20-30) usando un punzón de biopsia de 4 mm.
- Mida y registre las dimensiones físicas (diámetro y altura) de muestras representativas utilizando un micrómetro. Las construcciones debe ser aproximadamente 5 mm de altura, descartar cualquier muestras obtenidas de una región donde la varianza altura de la muestra fue mayor que 2%.
- Transferir las muestras a un nuevo 60 mm placa de Petri y suplementocon 10 ml de medio completo (20% por ejemplo, suero bovino fetal en medios de cultivo de Ham F-12 con 20 mM de HEPES, 100 g / ml de ácido ascórbico, y antibióticos / antimicóticos 2x).
3. La estimulación mecánica y radiomarcaje de condrocitos-agarosa hidrogeles
- Esterilizar en autoclave los componentes metálicos de la instalación de compresión. Esterilizar los componentes de plástico con 70% de etanol (durante la noche) y luz UV (por lo menos durante 15 min).
- Para mantener las construcciones que se caiga, usando fórceps, lugar 12 anillos de plástico estériles de retención (con un diámetro interior mayor que el diámetro constructo) (n = 6, muestras y controles) en los pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos.
- Utilizando pinzas, transferir cuidadosamente los hidrogeles de condrocitos-agarosa de la placa de Petri a la placa de 24-así, asegurando cada uno en un anillo de retención.
- Transferir 400 l de medio completo (por ejemplo, 20% de FBS en los medios de cultivo de Ham F-12 con 20 mM de HEPES, 100 ug / ml de ácido ascórbico, y2x antibióticos / antimicóticos) a cada pocillo de muestra.
- Montar la plataforma de compresión esterilizada (Figura 1) y fije las placas con tornillos de fijación. Una el equipo de perforación de compresión a la placa de cultivo de 24 pocillos.
- Suelte y vuelva a sujetar-los tornillos de ajuste para establecer platina de hidrogel de contacto (cero estado de deformación).
- Cargue la plataforma de compresión montado en un Mach-1 Testing System micromecánica. Plataforma segura para la etapa vertical mediante pasador de posicionamiento y bloqueo en su lugar con el tornillo de fijación. Retire la plantilla de interlineado.
- Aplicar una carga de compresión dinámica en amplitud deseada (por ejemplo, 10% de amplitud de deformación sobre la base de la altura original de las muestras), la frecuencia (por ejemplo, 1 Hz) y la duración o el número de ciclos (por ejemplo, intervalos de tiempo de hasta 60 min).
- Tras la finalización de la estimulación mecánica, sustituir la plantilla espaciamiento, afloje el tornillo de pasador de fijación localizar y eliminar la plataforma de compresión y la placa de cultivo de Mach-1 Testing System micromecánicos.
- Radiomarcador hidrogel células constructos suplementando el medio con 5 Ci de isótopo deseado (por ejemplo, [3 H]-prolina etiqueta de proteínas para la síntesis de colágeno específico de condrocitos y [35 S]-azufre para la síntesis de proteoglicanos).
- Incubar los constructos radiomarcados para 24 horas a 37 ° C, 5% CO 2 10.
- Cosechar los constructos de hidrogel radiomarcados y enjuague 3 veces en 1X PBS (pH 7,4) para eliminar cualquier isótopo no incorporado. Digest muestras usando papaína (40 ug / ml en 20 mM de acetato de amonio, 1 mM de ácido ethyldiaminetetraacetic y 2 mM de ditiotreitol a 65 ° C durante 72 hr).
- Ensayo para digerir el contenido de ADN mediante el ensayo PicoGreen tinte 11 y actividad incorporada isótopo, normalizado a contenido de ADN, por β-líquido de centelleo contando 12,13 digestión con papaína inmediatamente siguiente.
Nota: La compra y venta de materiales radiactivos (isótopos y elementos de desechoque puedan haber estado en contacto con materiales radioactivos) debe seguir el institucional relevante (y / o gubernamentales) Políticas y procedimientos para la manipulación y eliminación de sustancias radiactivas.
4. Los resultados representativos
Bovina condrocitos articulares-agarosa construcciones hidrogeles (2% de agarosa con 10 x 10 6 células / ml células encapsuladas) fueron estimuladas mecánicamente a una amplitud de 10% de deformación a la compresión a una frecuencia de 1 Hz durante 20 a 60 min (o 1.200 ciclos a 3.600 ) y se ensayó el contenido de ADN y la síntesis de matriz extracelular mediante la incorporación de radioisótopos. ADN y la síntesis de matriz extracelular se vio afectada de una manera dependiente de la dosis. Contenido de ADN mostraron una disminución significativa del 35% como resultado de 20 o 30 min de estimulación (p <0,01), mientras que 60 min de estimulación no mostró ningún efecto (Figura 2). Cartílago específicos de la síntesis de colágeno y proteoglicanos (determinado por [3 H]-prolina y[35 S]-azufre incorporación, respectivamente) mostraron incrementos significativos de aproximadamente 60% en respuesta a 20 o 30 min de estimulación (p <0,01), con 60 min de estimulación que no presenta efecto observable (Figura 3).
. Figura 1 Esquema de la plataforma de compresión dinámica hecha a la medida para estimular condrocitos agarosa construcciones de la izquierda:. Plataforma ensamblada Derecha:. Despiece que muestra los componentes individuales.
Cambios Figura 2. En el contenido de ADN de condrocito-agarosa hidrogeles mecánicamente estimulados bajo una amplitud de deformación 10% de compresión a 1 Hz durante 20 a 60 min (media ± SEM, n = 6/grupo).
Cambios Figura 3. En la síntesis de matriz extracelular (colágeno y proteoglicanos) de condrocito-agarosa hidrogeles mecánicamente estimulados bajo amplitud de la deformación a la compresión 10% a 1 Hz durante 20 a 60 minutos (media ± SEM, n = 6/grupo).
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Discusión
El método descrito para la aplicación de estímulos mecánicos controlados a la celda de semilla de agarosa hidrogeles permite la investigación directa en los efectos dinámicos de las fuerzas de compresión sobre el metabolismo de los condrocitos. El uso de la plataforma de pruebas de medida junto con los anillos de retención proporcionado restricción lateral para las construcciones para evitar problemas potenciales de la muestra de inflexión. El uso de platos de carga muerta ponderados fijados por los equipos conjun...
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo o equipo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| Ham F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Colagenasa A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Proteasa | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Suero Bovino Fetal | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbato | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibióticos / antimicóticos | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan azul | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemocitómetro | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| La papaína de la papaya látex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Acetato de amonio | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ácido Ethyldiaminetetraacetic | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-ditiotreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Bajo punto de fusión de agarosa, Tipo VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Pantalla de malla (200) Filtrar | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Tester micromecánico | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compresión Cargando Jig | Custom-construido | Producto similar podría ser suministrada por Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Placa de Cultura Bien | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-líquido contador de centelleo | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Azufre | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
