La biosíntesis de la matriz extracelular cartilaginosa por los condrocitos pueden ser afectados por la aplicación de estímulos mecánicos. Este método describe la técnica de aplicación de dinámicas tensiones compresivas a los condrocitos encapsulados en construcciones en 3D y la evaluación de los cambios inducidos en el metabolismo de los condrocitos.
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Artículo de método
La estimulación mecánica de condrocitos-agarosa hidrogeles
En este artículo
Resumen
Resumen
El cartílago articular sufre de una capacidad limitada de reparación deteriorados por el insulto mecánico o degradados por la enfermedad, tal como la osteoartritis. Para remediar esta deficiencia, varias intervenciones médicas se han desarrollado. Uno de tales métodos es para recubrir la zona dañada con cartílago de tejido de ingeniería, sin embargo, la ingeniería de tejidos típicamente carece de las propiedades bioquímicas y la durabilidad de cartílago nativo, cuestionando su supervivencia a largo plazo. Esto limita la aplicación de la ingeniería de tejido cartilaginoso a la reparación de pequeños defectos focales, basándose en el tejido circundante para proteger el material implantado. Para mejorar las propiedades del tejido desarrollado, la estimulación mecánica es un método popular utilizado para mejorar la síntesis de la matriz extracelular cartilaginosa, así como las propiedades mecánicas resultantes de la ingeniería tisular. La estimulación mecánica se aplica fuerzas al tejido construye análoga a las experimentadas in vivo. Estase basa en la premisa de que el entorno mecánico, en parte, regula el desarrollo y mantenimiento de 1,2 tejido nativo. La forma más comúnmente aplicado de la estimulación mecánica en la ingeniería de tejido de cartílago es la compresión dinámica a cepas fisiológicos de aproximadamente 5-20% a una frecuencia de 1 Hz a 1,3. Varios estudios han investigado los efectos de la compresión dinámica y han demostrado que tienen un efecto positivo sobre el metabolismo de los condrocitos y la biosíntesis, en última instancia, afectar a las propiedades funcionales del tejido 4-8 desarrollado. En este trabajo, se expone el método para estimular mecánicamente condrocitos agarosa construcciones de hidrogel bajo compresión dinámica y analizar los cambios en la biosíntesis a través de ensayos bioquímicos y radioisótopos. Este método también puede ser fácilmente modificado para evaluar cualquier cambio potencialmente inducidos en respuesta celular como resultado de estímulos mecánicos.
Protocolo
1. Aislamiento de condrocitos articulares primarios
Cosecha 10-15 rebanadas completo de cartílago de espesor de las superficies articulares de las articulaciones de animales (por ejemplo, la articulación metacarpiana-falángica de vacas esqueléticamente maduros obtenidos de un matadero local).
- Colocar las rodajas de cartílago en un 100 mm placa de Petri y se incuba en 20 ml de 0,5% de proteasa en Ham F-12 (w / v) durante 2 horas a 37 ° C. Enjuague tres veces en medios de cultivo de Ham F-12, y se incuba con 20 ml de 0,15% de colagenasa A en los medios de cultivo de Ham F-12 durante la noche a 37 ° C.
- Se filtra....
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Discusión
El método descrito para la aplicación de estímulos mecánicos controlados a la celda de semilla de agarosa hidrogeles permite la investigación directa en los efectos dinámicos de las fuerzas de compresión sobre el metabolismo de los condrocitos. El uso de la plataforma de pruebas de medida junto con los anillos de retención proporcionado restricción lateral para las construcciones para evitar problemas potenciales de la muestra de inflexión. El uso de platos de carga muerta ponderados fijados por los equipos conjun.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo o equipo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| Ham F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Colagenasa A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Proteasa | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Suero Bovino Fetal | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbato | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibióticos / antimicóticos | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan azul | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemocitómetro | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| La papaína de la papaya látex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Acetato de amonio | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ácido Ethyldiaminetetraacetic | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-ditiotreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Bajo punto de fusión de agarosa, Tipo VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Pantalla de malla (200) Filtrar | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Tester micromecánico | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compresión Cargando Jig | Custom-construido | Producto similar podría ser suministrada por Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Placa de Cultura Bien | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-líquido contador de centelleo | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Azufre | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
Referencias
- Grodzinsky, A. J. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).
- Kuettner, K. E. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clinical Biochemistry. 25
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Reimpresiones y permisos
