Un protocolo simple de preparar los extractos de tejido humano para ser utilizado como una fuente de antígenos funcionales en ensayos de células T se describe. Este método permite respuestas de células T a los antígenos derivadas de tejido a medir In vitro.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Extracción de los antígenos tisulares para Ensayos funcionales
En este artículo
Resumen
Resumen
Muchos de los objetivos de antígeno de la respuesta inmune adaptativa, reconocidos por células B y T, no se han definido 1. Esto es particularmente cierto en las enfermedades autoinmunes y el cáncer 2. Nuestro objetivo es investigar los antígenos reconocidos por las células T en la enfermedad de tipo 1 autoinmune diabetes 1,3,4,5. Para analizar humanos respuestas de células T contra el tejido en el que los antígenos reconocidos por las células T no se identifican hemos desarrollado un método para extraer antígenos de proteínas a partir de tejido humano en un formato que es compatible con los ensayos funcionales 6. Respuestas previamente, las células T a los extractos de tejido no purificados no se pudo medir debido a que los métodos de extracción de producir un lisado que contiene detergentes que eran tóxicas para las células humanas mononucleares de sangre periférica. Aquí se describe un protocolo para la extracción de proteínas de los tejidos humanos en un formato que no es tóxico para las células T humanas. El tejido se homogeneizó en una mezcla de butan-1-ol, acetonitrilo y water (BAW). La concentración de proteína en el extracto de tejido se mide y una masa conocida de la proteína se dividió en alícuotas en tubos. Después de la extracción, los disolventes orgánicos se eliminan por liofilización. Extractos de tejidos liofilizadas pueden almacenarse hasta que se necesite. Para uso en ensayos de la función inmunitaria, una suspensión de células inmunes, en medios de cultivo apropiados, se puede añadir directamente al extracto liofilizado. La producción de citocinas y la proliferación de PBMC, en respuesta a los extractos preparados con este método, se mide fácilmente. Por lo tanto, nuestro método permite la rápida preparación de lisados de tejidos humanos que se pueden utilizar como fuente de antígenos en el análisis de las respuestas de células T. Se sugiere que este método facilitará el análisis de la respuesta inmune adaptativa a los tejidos en el trasplante, el cáncer y la autoinmunidad.
Protocolo
1. Preparación de tejido de bazo
- Nota-todo el material humano debe ser tratado como potencialmente infeccioso y todos los procedimientos deben llevarse a cabo en un gabinete de flujo laminar clase II. El uso de tijeras y pinzas estériles, quitar grasa y tejido fibroso a partir de secciones de bazo (~ 1-2 cm de tamaño) y recortar la mayor cantidad de material de la cápsula exterior como sea posible.
- Cortar un trozo pequeño (1-2 cm 3) de tejido de bazo y colocar cada pieza en un tubo estéril Falcon de 50 ml.
- Snap-congelar los trozos de tejido por inmersión en N 2 líquido.
- Conservar a -80 ° C. Un protocolo s....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo fue desarrollado porque queríamos generar un extracto de tejido humano que estaba libre de productos químicos tóxicos como detergentes. Específicamente, se han utilizado para preparar los extractos de tejido humano que se pueden utilizar en ensayos de la función inmune humano in vitro. Los extractos preparados usando este protocolo también se puede reconstituir en cualquier tampón y se utiliza para muchos análisis bioquímicos, tales como la cromatografía de Western Blot o líquido. Esto hace que e.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo es apoyado por becas de la Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559007) y la Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) y el Plan de Infraestructuras de Operaciones del Gobierno de Victoria. Damos las gracias a los miembros del equipo Tom Mandel Islet Programa de Trasplante de aislamiento de islotes para la prestación de los tejidos humanos. Los tejidos humanos fueron recogidos y utilizados con la aprobación ética local (Hospital de San Vicente HREC-A 011/04 y de la Salud de San Vicente HREC-A 135/08).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| 5 ml 12 x 75 mm tubos de poliestireno estériles | BD Falcon | 352054 | |
| Tapones para tubos de tubos de poliestireno (arriba) | BD Falcon | 352032 | |
| Tubos de 50 ml estériles | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrilo | Mallinckradt Químicos | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogeneizador: PRO200 | Bio-estrategia | 01-01200 | 10 x 115 mm de diente de sierra generador |
| Liofilizador | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Aguja estéril de calibre 18-20 | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 |
Tabla 1. Reactivos y equipos específicos.
Referencias
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identificat....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Etiquetas
Extracci n de ant genos tisularessistema de solventes BAWmedici n de la concentraci n de prote nasprotocolo de liofilizaci nensayos de c lulas T humanasan lisis de citometr a de flujoensayo de proliferaci n de PBMCprocesamiento de tejido espl nicom todo de presentaci n de ant genospruebas de compatibilidad inmunol gica
