En el modelo animal descrito en el presente trabajo, se purificaron los anticuerpos IgG contra un tramo de 200 aminoácidos (aa 757-967) de colágeno VII se inyecta repetidamente a ratones que reproducen el fenotipo de formación de ampollas, así como características de la histo-e inmunopatológicos característicos a humanos epidermólisis bullosa adquirida (EBA) 1.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Granulocitos dependiente de autoanticuerpos inducidos por ampollas en la piel
En este artículo
Resumen
Resumen
Fenómenos autoinmunes se producen en individuos sanos, pero cuando la auto-tolerancia falla, la respuesta autoinmune puede dar lugar a una patología específica. Según Witebsky los postulados, uno de los criterios en el diagnóstico de una enfermedad autoinmune como es la reproducción de la enfermedad en animales de experimentación por la transferencia pasiva de anticuerpos. Para la epidermólisis bullosa adquirida (EBA), un prototipo de órganos específicos enfermedad autoinmune de la piel y membranas mucosas, varios modelos experimentales se establecieron recientemente. En el modelo animal descrito en el presente trabajo, se purificaron los anticuerpos IgG contra un tramo de 200 aminoácidos (aa 757-967) de colágeno VII se inyecta repetidamente a ratones que reproducen el fenotipo de formación de ampollas, así como funciones de la histo-e inmunopatológicos característicos a humanos EBA 1. El estallido de la enfermedad generalizada se ve generalmente 5-6 días después de la primera inyección y la extensión de la enfermedad se correlaciona con la dosis administrada de la collagen VII-IgG específica. El daño tisular (formación de ampollas) en la EBA experimental depende del reclutamiento y activación de granulocitos de tejido unidas a autoanticuerpos 2, -4. Por lo tanto, este modelo permite la disección de la vía inflamatoria dependiente de granulocitos implicados en el daño tisular autoinmune, como el modelo reproduce sólo las células T independiente de la fase eferente de la respuesta autoinmune. Además, su valor es subrayada por un número de estudios que demuestran el potencial de inducción de blister de autoanticuerpos in vivo e investigando el mecanismo de la formación de ampollas en EBA 1,3, -6. Por último, este modelo facilitará en gran medida el desarrollo de nuevas terapias antiinflamatorias en enfermedades inducidas por el autoanticuerpo. En general, el modelo de transferencia pasiva de los animales EBA es un modelo de la enfermedad accesible e instructivo y ayudará a los investigadores a analizar no sólo la patogenia EBA pero para responder fundamental biológica y clínicamentepreguntas esenciales autoinmunidad.
Protocolo
1. Preparación de anticuerpo patógeno
Nota: La purificación y concentración de los anticuerpos se debe realizar en el mismo día, ya que los anticuerpos no son para ser almacenados en 0,1 M de glicina pH 2,5 a 3 (tampón de elución) durante la noche (ON).
Purificación por afinidad de IgG: utilizar 25 ml de suero inmune de conejo:
- Descongele el suero de conejo en a 4 ° C, se mezcla 1:1 con tampón de 1xPBS () y centrifugar a 1260 se xg durante 10 min a 20 ° C. Opcionalmente, una etapa de filtración con papel de filtro podrían ser incluidos después de la centrifugación en caso de que el suero es graso.
- Mientras tanto, lavar la proteína G matriz llena la columna con 10 volúmenes de lecho (volumen del lecho = volumen de la matriz) de 1XPBS (running buffer).
- Aplicar el diluye y se filtra el suero a la columna y se incuba 1 h en la plataforma de agitación a temperatura ambiente (RT).
- Recoger el flujo a través (FT) en un tubo Falcon de 50 ml. No lo deseche hasta que la concentracióny el título de la IgG purificada se conoce.
- Lavar la matriz con 5 volúmenes de lecho de 1XPBS y mientras tanto preparar 50 ml tubos Falcon para la recogida de la fracción eluida con IgG. Pipetear 1 ml de tampón de pH neutralizante: 1 M Tris pH 10 en cada tubo (de lo contrario la proporción de 1:20 tampón TRIS relación a la cantidad de eluato a recoger).
- Aplicar 100-150 ml de tampón de elución: glicina 0,1 M pH 2.5-3 a la columna y recoger 50 ml fracción (s). Da la vuelta al tubo 2-3x, medir el pH y añadir tampón de neutralización hasta que haya alcanzado el pH 7.2-7.4.
- Recoger gotas de eluido IgG y utilizando el tampón de elución como etalón medir la DO a 280 nm. Si el OD es <0,1 recolección de parada.
- Regenerar la matriz de proteína G y almacenarlo siguiendo las instrucciones del fabricante.
Concentración por ultrafiltración Amicon con tubos:
- Lavar el Ultra Amicon (15 ml / 30kDa) tubos de ultrafiltración por centrifugación con 1XPBS min 15-20a 3.220 xg, a 4 ° C. Deseche la FT del Amicon.
- Llenar los Amicons con 15 ml de fracción eluida con IgG y centrifugar durante 25-30 min a 3.220 xg y 4 ° C, el tiempo de centrifugación siempre depende del contenido de proteína del eluato.
- Deseche FT y repetir hasta ultrafiltración tiene ninguna fracción eluida a la izquierda.
- Lavar el concentrado IgG ampliamente, dos veces, con 1XPBS 25-30 min de centrifugación.
- Recoger el "pegajosos", solución de anticuerpo amarillento del filtro Amicon en un volumen final de 1,500-2,000 l de 1XPBS.
- Medir la concentración de preparación de IgG usando un espectrofotómetro o NanoDrop:
Conc. (Mg / ml) = A (280 nm) x factor de dilución / 1,4 - Lavar y almacenar los Amicons siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. La inyección de colágeno VII-IgG específica en ratones
Antes de iniciar el procedimiento experimental actual, asegúrese de que el pro experimentaltocol está escrito y todos los materiales se preparan para el experimento.
- Preparar las hojas de datos para la toma de la enfermedad, las pruebas ELISA, inmunofluorescencia (IF) el análisis y la mieloperoxidasa (MPO) de ensayo 4.
- Etiquete los tubos de sangre y de órganos, así como criomoldes histología procesamiento y la inclusión cassettes.
- Las soluciones de anticuerpos debe ser preparado fresco o descongelado de las existencias y caracterizado con respecto a su reactividad (título por microscopía de IF y / o ELISA). La solución filtrada estéril de anticuerpos debe ser diluido en PBS de manera que la dosis requerida para la inyección varía entre 250-1000 l. Asegúrese de que tiene suficiente IgG para llevar a cabo el experimento.
- Preparar fresco anticoagulante: heparina 20 U / ml y 8,7 mg / ml de ketamina / 1,3 mg / ml de mezcla de xilazina para la anestesia. Al sacrificar los ratones han etiquetado tubos con 3,7% de formaldehído preparado.
- Esterilizar instrumental quirúrgico (bisturí, tijeras, punta fina y Curved forcipes) y preparar jeringas (jeringas de insulina, jeringas de 1 y 2 ml), agujas, cámara digital y tarjeta de memoria adicional.
Nota: Realice todos los procedimientos realizados en ratones narcotizados ketamina / xilazina o isoflurano isoflurano es la opción preferida para la anestesia de los controles diario de la piel, como los ratones se recuperan rápidamente.. Sin embargo, cuando se toman fotografías ketamina, 87 mg / kg y 13 mg xylazina / kg generalmente se inyecta por vía subcutánea. Para la eutanasia la dosis de ketamina / xilazina se aumenta a 130 mg / kg de ketamina y xilazina 20 mg / kg.
- Compruebe los animales ya marcados por su estado general de salud, la piel y la apariencia de piel, pesarlos y medir su espesor de la oreja (siempre se adhieren a la misma oreja).
- Registrar los valores observados y los cambios en la hoja de evaluación clínica.
- Recoger 20-30 l (2-3 gotas) de sangre de la vena de la cola en una jeringa que contiene el mismo volumen de anticoagulante.
- Desinfecte la piel ypiel con 80% de etanol.
- Se inyecta la solución de anticuerpo por vía subcutánea en la parte posterior usando una jeringa de insulina. (Para determinados sitios (por ejemplo, de las orejas) sólo volúmenes pequeños (10-50 l) son factibles de ser inyectado.)
Las inyecciones se repetirán cada segundo día, 4 veces. Balb / c y ratones C57BL6 de un peso corporal de aproximadamente 20 g comenzar a desarrollar la enfermedad 3-4 días después de la primera administración de 400-500 hasta 750 mg / g de peso corporal / inyección autoanticuerpos.
Al terminar el experimento:
- Poner los ratones bajo anestesia profunda mediante la inyección de 130 mg / kg y 20 mg / kg de ketamina / xilazina por vía subcutánea, ellos exsanguinate de la vena cava posterior y cortar el corazón.
- Recoger muestras de tejidos / órganos como la piel: rabo, las orejas, la sangre y el esófago y los pusieron en tubos previamente marcados y llenos de formaldehído PBS o el 3,7%.
Al volver a lalaboratorio:
- Se centrifuga la sangre a 1.200 xg, 10 min a TA para separar el plasma, el plasma transferir a tubos adecuadamente etiquetados y almacenarlos en consecuencia.
- Insertar la biopsia de piel en medio de la temperatura óptima de corte utilizando criomoldes correctamente, la etiqueta, y almacenar a -80 ° C.
- Coloque las muestras de tejidos destinados a la histología en los moldes de incrustación etiquetados y mantenerlos en el 3,7% de formaldehído hasta la inclusión en parafina.
3. Evaluación clínica de la gravedad de la enfermedad
Los ratones se examinaron diariamente para las lesiones de la piel y las mucosas y los resultados deben registrarse utilizando formularios correspondientes. Los criterios para una eutanasia precoz es lesiones de la piel que afecta a más que 20% de la superficie corporal y una pérdida de peso del 5-10% del peso corporal total en tres días consecutivos, contando para una puntuación de la enfermedad de 5 (Tabla 1).
- Coloque el cursor sobre su vientre. Comenzar con el área de la cabeza, es decir, con el derechooído y comprobar para ampollas, erosiones, costras en el interior así como en el lado exterior. Continúe de la misma manera con el oído izquierdo.
- Los ojos derecho e izquierdo son controlados para detectar signos de eritema, alopecia, erosiones y / o corteza.
- Frente y el área hocico se cepillan a través siguiente, continuando con la parte ventral de la boca, los labios y la mucosa de la boca.
- Examine la pata delantera derecha a partir de la pata, moviéndose hacia arriba, cambiar a la pata delantera izquierda. El mismo procedimiento que con las patas traseras derecha e izquierda.
- Cepille a través de la piel en el cuello y la zona de la espalda con unas pinzas de punta fina curva.
- Ponga el ratón sobre su espalda y comprobar la parte ventral, así como los lados ventrales de las extremidades de la misma forma que anteriormente.
- Compruebe la cola.
- Tome fotos de las partes del cuerpo pertinentes cuando los ratones desarrollan la enfermedad. Se debe prestar atención a la calidad y cantidad de las imágenes.
- Calcular los resultados clínicos de la enfermedad.
4. Análisis de muestras de piel y Plasma
- Elaborar, almacenar y / o procesar todos los tejidos recogidos de acuerdo con el plan.
- Corte secciones de tejido congeladas por si la detección de anticuerpos de conejo y de ratón componentes del sistema del complemento.
- Analizar los diferentes contenidos de proteína y enzima (MPO ensayo) de tejido congelados y / o extractos de órganos.
- Sección el tejido embebido en parafina y tinción con H & E para visualizar la magnitud del daño tisular.
- Analizar el plasma por ELISA, inmunotransferencia.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La transferencia pasiva de anticuerpos específicos de antígenos resultado de una enfermedad por completo soplado en ratones, se asemejan a los niveles clínicos, histológicos e inmunopatológicos la EBA humana. Las ampollas, costras y alopecia, erosiones desarrollar en las orejas, el hocico, patas, piernas, espalda y alrededor de los ojos de los ratones. Los primeros signos clínicos de la enfermedad es muy probable que aparezcan en los oídos y / o área de la cabeza. La deposición de IgG específica de conejo, ratón y compl...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La transferencia pasiva de anticuerpos en animales de experimentación es un enfoque importante para demostrar su patogenicidad 7, -12. Los modelos animales obtenidos a través de este método, además de ser la evidencia indirecta de la autoinmunidad 13, permitir la investigación de la fase eferente de los mecanismos patogénicos. El modelo de transferencia pasiva de anticuerpos inducidos por granulocitos dependiente de la formación de ampollas en la piel epidermólisis bullosa adquirida (EBA) fue utili...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Los autores reconocen el apoyo de subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 y BIOSS de la Facultad de Medicina de la Universidad de Friburgo (para CS).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| antígeno recombinante | La codificación de los plásmidos de las formas recombinantes de colágeno VII murino están disponibles en el autor correspondiente. | ||
| suero inmune de conejo | www.eurogentec.com | Tuvimos conejos Nueva Zelanda Blanco inmunizados con 200 g de antígeno, 3 veces a intervalos de 2 semanas. Para ello se han utilizado los servicios de Eurogentec SA, Bélgica. | |
| Proteína G agarosa | Roche Applied Science | 11243233001 | |
| Ratones Balb / c | Charles River Laboratories | ||
| Compuesto OCT, Tissue-Tek | Sakura Finetek | 4583 | Octubre, la temperatura óptima de corte |
| Criomolde estándar | Sakura Finetek | 4557 | 25 mm × 20 mm × 5 mm |
| Criomolde intermedio | Sakura Finetek | 4566 | 15 mm x 15 mm x 5 mm |
| Uni-Link-Einbettkassette | R. Langenbrinck | 09-0503 | Histología procesamiento y cassettes incrustación |
| Spezial-Tatowierfarbe Schwarz | H. Hauptnerund & Richard Herberholz GmbH & Co. KG | 71492000 | tatuajes pasta |
| Tatowierzange TZ1 | EBECO E. Becker & Co GmbH | tatuajes dispositivo | |
| La heparina | Carl Roth GmbH & Co. | 7692.1 | |
| Formaldehído 37% | Carl Roth GmbH & Co. | 7386 | |
| El clorhidrato de ketamina | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | K2753-1G | |
| Xilazina clorhidrato | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | X1251-1G | |
| PBS estéril | Biochrom | L182-50 | |
| cámara digital | Nikon | Coolpix 5400 | |
| Jeringuilla accionada por unidad de filtro de 0,45 micras | Millipore | ||
| Caliper | Mitutoyo 7309 | 1667338 | Farnell (distribuidor) |
| enfermedad hoja de puntuación | ejemplo enclosed |
Referencias
- Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen. J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).
- Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 225, 401-413 (2011).
- Kulkarni, S., Sitaru, C., Jakus, Z., Anderson, K. E., Damoulakis, G., Davidson, K. PI3Kβ plays a critical role in neutrophil activation by immune complexes. Sci. Signal. 4, 23-23 (2011).
- Chiriac, M. T., Roesler, J., Sindrilaru, A., Scharffetter-Kochanek, K., Zillikens, D., Sitaru, C. NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage. J. Pathol. 212, 56-65 (2007).
- Mihai, S., Chiriac, M. T., Takahashi, K., Thurman, J. M., Holers, V. M., Zillikens, D. The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Immunol. 178, 6514-6521 (2007).
- Sesarman, A., Sitaru, A. G., Olaru, F., Zillikens, D., Sitaru, C. Neonatal Fc receptor deficiency protects from tissue injury in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Mol. Med. 86, 951-959 (2008).
- Huang, X. R., Holdsworth, S. R., Tipping, P. G. Th2 responses induce humorally mediated injury in experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol. 8, 1101-1108 (1997).
- Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C., Mathis, D. Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme. Science. 286, 1732-1735 (1999).
- Oswald, E., Sesarman, A., Franzke, C., Wölfle, U., Bruckner-Tuderman, L., Jakob, T. The flavonoid luteolin inhibits Fcγ-dependent respiratory burst in granulocytes, but not skin blistering in a new model of pemphigoid in adult mice. PLoS One. 7, e31066(2012).
- Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180. J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).
- Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease. N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).
- Toyka, K. V., Brachman, D. B., Pestronk, A., Kao, I. Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse. Science. 190, 397-399 (1975).
- Rose, N. R., Bona, C. Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited. Immunol. Today. 14, 426-430 (1993).
- Sitaru, C. Experimental models of epidermolysis bullosa acquisita. Exp. Dermatol. 16, 520-531 (2007).
- Sitaru, C., Kromminga, A., Hashimoto, T., Bröcker, E. B., Zillikens, D. Autoantibodies to type VII collagen mediate Fcgamma-dependent neutrophil activation and induce dermal-epidermal separation in cryosections of human skin. Am. J. Pathol. 161, 301-311 (2002).
- Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice. Immunol. Lett. , (2012).
- Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 224, 234-244 (2011).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
