Trazado de Circuitos Viral genéticamente definidos Neural

Resumen

Un método de rastreo de neuronas conectadas sinápticamente se describe. Usamos especificidad TVA de una célula de aguas arriba para probar si una población celular de interés recibe la entrada sináptica de tipos de células genéticamente definidos.

Resumen

Los métodos clásicos para el estudio de los circuitos neuronales están rendimiento bastante bajo. Transsynaptic virus, particularmente la pseudorrabia (PRV) y virus de la rabia (RABV), y más recientemente virus de la estomatitis vesicular (VSV), para el estudio de circuitos, es cada vez más popular. Estos métodos de rendimiento más altos utilizan virus que transmiten entre las neuronas, ya sea en la dirección anterógrada o retrógrada.

Recientemente, un RABV modificado para monosináptico retrógrada rastreo fue desarrollado. (Figura 1A). En este método, la glicoproteína (G) de genes se elimina del genoma viral, y reabastecidos sólo en las neuronas específicas. Especificidad infección se logra mediante la sustitución de una G quimérico, formado por el dominio extracelular de la glicoproteína ASLV-A y el dominio citoplásmico de la RABV-G (A / RG), para el normal RABV-G ^1. Este G quimérica específicamente infecta las células que expresan el receptor TVA ^1. El gen que codifica TVA puede sido delivered por diversos métodos ^2-8. Tras RABV-G infección de una neurona TVA-expresando, el RABV puede transmitir a otras neuronas, conectadas sinápticamente en una dirección retrógrada por la naturaleza de su propio G que fue cosuministrado con el receptor de TVA. Esta técnica etiqueta un número relativamente grande de entradas (5-10%) ² en un tipo celular definido, proporcionando un muestreo de todas las entradas en un tipo de célula de arranque definido.

Recientemente hemos modificado esta técnica a utilizar VSV como un trazador transsynaptic ^9. VSV tiene varias ventajas, incluyendo la rapidez de la expresión génica. A continuación detallamos un nuevo sistema de rastreo viral utilizando útiles para sondear microcircuitos con mayor resolución VSV. Mientras que las estrategias original publicado por Wickersham et al. ⁴ y Beier et al. ⁹ permiso de etiquetado de cualquier neuronas que se proyectan hacia inicialmente infectado-TVA-expresando células, aquí VSV fue diseñado para transmitir sólo a TVCélulas que expresan A-(Figura 1B). El virus es primero pseudotyped con RABV-G para permitir la infección de aguas abajo de las neuronas que expresan TVA neuronas. Después de infectar esta primera población de células, el virus liberado sólo pueden infectar células que expresan TVA. Debido a la propagación viral transsynaptic se limita a las células que expresan TVA, la presencia de ausencia de la conectividad de los tipos de células definidos pueden ser explorados con alta resolución. Un diagrama de flujo experimental de estos experimentos se muestra en la Figura 2. Aquí se muestra un circuito de modelo, el de la dirección de selectividad en la retina del ratón. Se examina la conectividad de las células amacrinas starburst (ZEC) a las células ganglionares de la retina (CGR).

Protocolo

1. Haciendo Virus de cDNA: Recuperación de VSV de cDNA utilizando la vacuna-T7 System ¹⁰

1. Un día antes del experimento, dividir BsrT7 células en placa de 60 mm que contiene DMEM + 10% de FBS. Semillas 2E6 células por placa. BsrT7 células se derivan de BHK21, o riñón de cría de hámster, células.
2. PBS caliente con magnesio 1 mM y 1 mM de calcio a 37 ° C.
3. Obtener una pequeña alícuota vTF7-3, un virus vaccinia que expresa la polimerasa T7, y descongelación a temperatura ambiente. vTF7-3 es un virus vaccinia infeccioso que expresa la polimerasa T7 ^11, y se debe utilizar solamente en el nivel de Bioseguridad 2 de contenció....

Discusión

Uso de virus para estudiar circuitos neuronales es un método de rendimiento relativamente alto de analizar neuronas conectadas. Sin embargo, generar tanto VSV y viriones RABV no es trivial. Aunque el protocolo enumerados anteriormente para el virus de rescate a partir de ADNc se proporciona, todavía es un evento de baja probabilidad. Los niveles de cada uno de los N, P, L y plásmidos necesitan ser ajustado con precisión, ya que muchos ensayos y replica necesita hacer para asegurar rescate viral. La formación de la partí.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cultivo de tejidos
Células de riñón de hámster fetal (BSRT7)	disponibles bajo solicitud
vacuna (vTF7-3)	disponibles bajo solicitud
plásmidos pN, pP, pl	disponibles bajo solicitud
Cloruro de calcio	Sigma	C1016
Cloruro de magnesio	Sigma	M8266
Células HEK 293T	Open Biosystems	HCL4517
Placa de cultivo de 60 mm tratada para cultivo celular (TC)	Corning	430166
Matraz rectangular de cuello inclinado de 75 cm2 con tapón ventilado	Corning	430641
Medio: DMEM (Medio de Eagle modificado por Dulbecco)	Invitrogen	12491-015
HEPES 1 M, pH 7,4	Gibo	15630-080
SFB: Suero bovino fetal	Gibco	10437-028
PKS	Invitrogen	15140-163
Reactivo de transfección Lipofectamina 2,000	Invitrogen	11668-019
Jeringa: jeringa Luer-Lock de 5 ml	Sigma	Z248010-1PAK
Filtros para jeringa	Nalgene	190-2520
PEI: PEI lineal de alta potencia	Polysciences	23966
Centrifugación viral
Sistema de filtro de vacío con tubo superior de 150 ml de Corning, poro de 0,45 μm	Corning	430314
Tubos ultracentrífugos delgados, ultraclaros, de 38,5 ml, 25 x 89 mm	Beckman-Coulter	344058
Ultracentrífuga	Beckman-Coulter	optima XL-80K
Rotor de ultracentrífuga SW28	Beckman-Coulter	342207
Inyección en ratón
Micropipetas capilares	Drummond	5-000-2005
Stereotax	Narishige	SR-5M
Micromanipulador	Narishige	SM-15
inyector Ump	World Precision Instruments	Sys-Micro4
Microcontrolador de cuatro canales	World Precision Instruments	UMP3
M.TXB Motor de banco con control de dial C.EMX-1, 115 voltios	Foredom	M.TXB-EM
Mano H.10, cambio rápido	Foredom	H.10
Broca escalonada, 0,5 mm	Foredom	A-58005P
Soporte de micr–electrodo	World Precision Instruments	MEH2S
Quetamina	Henry Schein	995-2949
Xilacina	Henry Schein	4015809TV
Buprenorfina	Henry Schein	1118217
Jeringa de 1 ml	Becton-Dickinson	309628
Aguja de inyección de calibre 30	Becton-Dickinson	305106
Pomada oftálmica protectora	Doctors Foster and Smith	9N-014748
Etileno	Sigma	493511
Yodo	Sigma	PVP1
Herramientas de cirugía y disección
Tijeras	Fine Science Tools	91402-12
Pinzas estándar	Fine Science Tools	11000-12
Pinzas finas	Fine Science Tools	11255-20
Tijeras de resorte Vannas	Fine Science Tools	15000-00
Mango de bisturí	Fine Science Tools	10003-12
Cuchillas de bisturí	Fine Science Tools	10015-00
Suturas	Robbins Instruments	20.SK640
Disección y tinción con anticuerpos
paraformaldehído	Sigma	P6148
Solución salina tamponada con fosfato	Sigma	P4417
Tritón X-100	Sigma	T9284
Suero de asno	Jackson Immunoresearch	017-000-121
Anticuerpos
Anticuerpos	millipore	AB144P
Anti-gfp	Abcam	ab13970
Donkey anti-chicken Dylight 488	Jackson immunoresearch	703-545-155
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647	Jackson immunoresearch	705-605-147
DAPI	Invitrogen	D1306
Montaje de tejidos
Portaobjetos microscópicos Superfrost plus	Fisher	12-550-100
Cubreobjetos 22 x 22, grosor 0	Electron Microscopy Sciences	72198-10
Elastómero de silicona	Rogers Corp	HT-6220
Esmalte de uñas transparente	Electron Microscopy Sciences	72180
Reactivo antifade Prolong Gold	Invitrogen	P36930