Iterativo de optimización de dúplex de ADN para la cristalización de SEQA-ADN complejos

Resumen

Estructura cristalina de los complejos de proteínas de ADN puede proporcionar información sobre la función de proteínas, el mecanismo, así como, la naturaleza de la interacción específica. Aquí reportamos cómo optimizar la longitud, la secuencia y los extremos del ADN dúplex en co-cristalización con Escherichia coli SEQA, un regulador negativo de la iniciación de la replicación.

Resumen

Escherichia coli SEQA es un regulador negativo de la replicación del ADN que impide prematuros eventos reiniciación por secuestrantes GATC grupos hemimethylated dentro del origen de replicación ^1. Más allá del origen, SEQA se encuentra en las horquillas de replicación, donde se organiza ADN recién replicado en mayores estructuras ordenadas ^2. Asociados SEQA sólo débilmente con las secuencias GATC individuales, sino que forma complejos de alta afinidad con dúplex de ADN que contienen múltiples sitios GATC. La unidad mínima funcional y estructural de SEQA es un dímero, lo que explica el requisito de al menos dos secuencias GATC para formar un complejo de alta afinidad con el ADN hemimethylated ^3. Además, la arquitectura SEQA, con la oligomerización y dominios de unión al ADN separados por un enlazador flexible, permite la unión a repeticiones GATC separados por hasta tres vueltas helicoidales. Por lo tanto, la comprensión de la función de SEQA a nivel molecular estructural requiere la analisis de SEQA unido a múltiples secuencias GATC. En la cristalización de proteínas-ADN, el ADN puede tener ninguno a un efecto excepcional en las interacciones de embalaje en función de los tamaños relativos y la arquitectura de la proteína y el ADN. Si la proteína es más grande que el ADN o huellas de la mayoría del ADN, el cristal de embalaje es principalmente mediada por interacciones proteína-proteína. A la inversa, cuando la proteína es del mismo tamaño o más pequeño que el ADN o sólo cubre una fracción de las interacciones ADN, ADN-ADN y ADN-proteína dominar cristal de embalaje. Por lo tanto, la cristalización de proteínas de ADN complejos requiere el cribado sistemático de ADN de longitud y ⁴ extremos de ADN (romo o saliente) ^5-7. En este reporte se describe cómo diseñar, optimizar, purificar y cristalizar hemimethylated dúplex de ADN que contienen repeticiones en tándem GATC en el complejo con una variante dimérica de SEQA (SeqAΔ (41-59)-A25R) para obtener cristales adecuados para la determinación de la estructura.

Protocolo

1. Purificación de proteínas

El enlazador flexible que une el. N-(oligomerización) y C-terminal (de unión a ADN) dominios de SEQA SIDA el reconocimiento de hemimethylated repite GATC separados por uno a tres vueltas en el ADN Para este estudio, se utilizó una variante dimérica de SEQA (SeqAΔ (41-59)-A25R) con una mutación puntual en el dominio N-terminal que impide aún más la oligomerización y un enlazador acortado que restringe la unión al ADN en tándem para GATC repite separados exclusivamente por una vuelta en el ADN (Figura 1) ^2,8.

1. Transformar BL21 (DE3) células con el plásmido que codifica SEQA ....

Discusión

Uno de los mayores retos en macromolecular cristalografía de rayos X es la obtención de cristales de difracción de calidad. En el caso de complejos de proteínas o ADN-proteína, este reto se agrava debido a las variables adicionales que deben ser optimizados. Se cree ampliamente que la longitud del ADN y la presencia de voladizos pegajosas para mejorar la asociación de moléculas de ADN vecinos en un tiempo pseudo-duplex son los principales parámetros a optimizar. Sin embargo, hemos demostrado que la naturaleza y duración.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Catálogo #	Comentarios (opcional)
TRIS	Bioshop	TRS003.5
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Fisher Scientific	E478-500
Dithiotheitrol (TDT)	Bio Basic Inc.	DB0058
NaCl	Bioshop	SOD002.10
Glicerol	Caledon	5350-1
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S5016-500G
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	Bioshop	SDS001.500
Urea	Bioshop	URE001.5
40% Bis 29:1 / acrilamida	Bio Basic Inc.	A0007-500ml	Almacenar a 4 ° C
El ácido bórico	EMD	BX0865-1
Xileno FF cianol	Bio-Rad	161-0423
Azul de bromofenol	Bioshop	BR0222
Sistema Dual Adjustable Gel Vertical	CBC Scientific Company Inc.	DASG-250
Índice de pantalla cristalización	Hampton Research	HR2-144	Almacenar a 4 ° C
Asistente Yo pantalla cristalización	BioSystems Esmeralda	EBS-WIZ-1	Almacenar a 4 ° C
Wizard II pantalla de cristalización	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-2	Almacenar a 4 ° C
Clásicos pantalla cristalización	Qiagen	130701	Almacenar a 4 ° C
Intelliplate bandejas	Art Robbins Instrumentos	102-0001-00
			Soluciones Proteína tampón de purificación: 100 mM Tris pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT y 5% de glicerol. Proteína tampón de almacenamiento: 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,5 mM EDTA y 5% de glicerol. Gel mezcla de carga: Añadir 20 g de sacarosa, 25 mg de azul de bromofenol, 25 mg de xileno cianol FF, 1 ml de 10% w / v de SDS y 10 ml de TBE 10X a 70 ml de ddH autoclave 2 O. Se agita con calentamiento suave hasta que la sacarosa se disuelve y ajustar la finalvolumen a 100 ml con ddH autoclave 2 O. Almacenar a 4 ° C. Tampón de carga 2X: Añadir 11 g de urea a 10 ml de mezcla de carga de gel. Se agita sobre una placa caliente hasta que se disuelve la urea. Dividir en partes alícuotas en tubos de 2 ml y se almacena a 4 º C. Mezcla PÁGINA 10X: Mix 420,4 g de urea, 100 ml de TBE 10X (autoclave), 250 ml de 40% 29:1 Bis / acrilamida en ddH 2 O. Agitar hasta que esté totalmente disuelto y ajustar el volumen a 1 litro. Almacene en botellas oscuras a 4 ° C. 10X TBE: Disolver 108 g de TRIS, 55 g de ácido bórico y 9,3 g de EDTA en 1 litro de ddH 2 O. Autoclave y almacenar a temperatura ambiente. Tampón de elución: Diluir 8 ml de 5 M NaCl, 2 ml de 1 M Tris pH 7,5, 0,4 ml de 0,5 M EDTA pH 8 en 200 ml de ddH 2 O. Autoclave y almacenar a temperatura ambiente.