El examen de selección tímica positivo y negativo por citometría de flujo

Summary

Se presenta una citometría de flujo basado en el método para examinar el desarrollo de las células T In vivo Utilizando ratones genéticamente manipulados en un fondo de tipo salvaje o receptor de células T transgénicos.

Abstract

Un sistema inmunológico saludable requiere que las células T responden a antígenos extraños sin dejar de ser tolerante a antígenos propios. Reordenamiento aleatorio del receptor de células T (TCR) α y β loci genera un repertorio de células T con una gran diversidad en la especificidad de antígeno, tanto para uno mismo y extranjeros. Selección del repertorio durante el desarrollo en el timo es crítico para la generación de células T segura y útil. Los defectos en la selección tímica contribuir al desarrollo de trastornos autoinmunes e inmunodeficiencia ^1-4.

Progenitores de células T entrar en el timo como dobles negativas (DN) timocitos que no expresan CD4 o CD8 co-receptores. Expresión de la αβTCR y ambos receptores co-ocurre en el doble positiva (DP) etapa. Interacción de la αβTCR con el auto-péptido-MHC (pMHC) presentados por células tímicas determina el destino de la timocitos DP. Interacciones de alta afinidad conducir a la selección negativa y la eliminaciónción de las materias autorreactivas timocitos. Interacciones de baja afinidad resultado en la selección positiva y el desarrollo de las células CD4 o CD8 individuales positivos (SP) células T capaces de reconocer antígenos extraños presentados por auto-MHC ^5.

La selección positiva puede ser estudiada en ratones con un anticuerpo policlonal (tipo salvaje) repertorio TCR mediante la observación de la generación de células T maduras. Sin embargo, no son ideales para el estudio de selección negativa, que implica la supresión de pequeñas poblaciones específicas de antígeno. Muchos sistemas modelo se han utilizado para estudiar la selección negativa, pero varían en su capacidad para recapitular los eventos fisiológicos ^6. Por ejemplo, la estimulación in vitro de timocitos carece del entorno del timo que está íntimamente involucrada en la selección, mientras que la administración de antígeno exógeno puede conducir a la supresión no específica de los timocitos ^7-9. En la actualidad, las mejores herramientas para estudiar en la selección negativa vivo son ratones que expresan una transgenic TCR específico para el auto-antígeno endógeno. Sin embargo, muchos clásicos modelos transgénicos TCR se caracterizan por prematura expresión de la cadena TCRα transgénica en la etapa de DN, lo que resulta en la eyaculación de selección negativa. Nuestro laboratorio ha desarrollado el modelo HY ^CD4, en el que el transgénico HY TCRα está condicionalmente expresó en la fase DP, permitiendo la selección negativa que se producen durante la transición a DP SP como ocurre en ratones de tipo salvaje ^10.

Aquí se describe un flujo de citometría de protocolos para examinar la selección tímica positivo y negativo en el modelo de ratón HY ^CD4. Mientras que la selección negativa ^en las células CD4 HY ratones es muy fisiológico, estos métodos también se pueden aplicar a otros modelos transgénicos TCR. También se presentarán las estrategias generales para el análisis de la selección positiva en un repertorio policlonal aplicable a cualquier ratones genéticamente manipulados.

Protocol

Consulte la Figura 1 para un esquema general del protocolo experimental.

1. Disección

1. Place acero estéril pantalla de malla en 60 x 15 mm plato Petri. Una unidad se necesita por muestra de tejido.
2. Añadir 5 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a cada placa. Mantenga los platos en hielo.
3. Eutanasiar ratones con CO _2.
4. Ratón segura a la superficie de la disección, la parte ventral hacia arriba. Spray de ratón con 70% de etanol para la esterilización y para asegurar que la piel es enredado abajo.
5. Usando tijeras quirúrgicas, comenzar la disección haciendo ....

Results

En fisiológicos TCR modelos transgénicos y ratones WT, la selección positiva se inicia en la etapa DP ^brillante antes de pasar a la etapa de DP ^aburrido después del encuentro de antígeno. Timocitos DP ^aburridos a continuación, introduzca un CD4 ⁺ CD8 etapa de transición antes de convertirse en ^lo CD4SP o timocitos CD8SP (Figura 2B). Timocitos maduros SP se caracteriza por la alta expresión de TCR y la pérdida de CD24 (Figura 2C). Mi.......

Discussion

El protocolo presentado aquí puede ser utilizado para examinar la selección positiva y negativa en no-TCR transgénicos y ratones transgénicos TCR. Este protocolo describe la tinción de antígenos de superficie. Para un análisis más detallado de los mecanismos moleculares, a menudo es necesario para realizar la tinción intracelular. Usamos la BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit para la mayoría de las proteínas intracelulares y el Kit de BD Biosciences Foxp3 de tinción para los factores de transcripción. Por lo general, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Solución salina equilibrada de Hank HyClone	Thermo Scientific	SH30030.02
Pantallas metálicas de malla	Cedarlane	CX-0080-E-01
Placas de Petri (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	877221
Jeringuillas (3 ml)	BD Biosciences	309657
Tubos cónicos (15 ml)	Sarstedt	62.554.205
Microscopio	Zeiss - Primo Star	415500-000-00XX
Hemocitómetro	HausserCientífico	3110
Placa de 96 pocillos	Sarstedt	82.1582.001
Pipeta multicanal	Fisherbrand	21-377-829
Suero de ternero fetal	PAA	A15-701
Salina tamponada con fosfato	Fisher Scientific	SH3025802
Sodio azida	IT Baker Chemical Co.	V015-05
FcR reactivo de bloqueo			Clone 2.4G2
Anti-ratón HY TCR	eBioscience	XX-9930-YY *	Clone T3.70
Mouse anti-CD4	eBioscience	XX-0042-YY *	Clone RM4-5
Lanti-ratón CD8	eBioscience	XX-0081-YY *	Clone 53-6.7
Anti-CD24 de ratón	eBioscience	XX-0242-YY *	Clone M1/69
Anti-ratón TCRβ	eBioscience	XX-5961-YY *	Clon H57-597
Anti-CD69 de ratón biotinilado	eBioscience	13-0691-AA *	Clone H1.2F3
Anti-ratón biotinilado CD5	eBioscience	13-0051-YY *	Clone 53-7.3
Estreptavidina	eBioscience	XX-4217-YY *
Citómetro de flujo	BD Biosciences - FACS Canto	338962
FACS tubos	BD Biosciences	352052
La citometría de flujo de software de análisis	TreeStar - FlowJo	FlowJo v7 / 9
HyClone medio RPMI - 1640	Thermo Scientific	SH30027.01
			* XX varía según el fluorocromo y YY varía según el tamaño del vial.