在小鼠的脑出血模型：注射自体血液或细菌胶原酶

Summary

脑出血（ICH）的临床相关的动物模型，需要扩大我们的出血性中风的知识，并研究新的治疗策略。在这项研究中，我们描述和评价两种的ICH模式，实行单方面或自体全血或细菌胶原酶注射到小鼠基底神经节（纹状体）。

Abstract

自发性脑出血（ICH）定义了一个潜在的危及生命的神经系统毛病，占10％至15％的所有行程相关的住院和没有有效的治疗是迄今为止^1,2。由于人类非物质文化遗产的异质性，不同的临床前模型中需要深入探讨未来的治疗策略^3。实验性脑出血通常是在啮齿类动物中引起的脑实质内注射或自体血或细菌胶原酶^4。选择合适的模型是根据出血的病理生理机制的诱导和伤害的进展。注血模型模拟了迅速进展的出血。另外，细菌胶原酶酶会破坏脑毛细血管基底膜，造成一个活跃的出血，一般发展几个小时。从可量化的结果血肿周围组织水肿和神经功能障碍米两种模式。在本研究中，我们描述和评价的改性双注入模型，自体全血^6，以及一个ICH注入模型的细菌胶原酶⁷基底节雄性CD-1小鼠（纹状体区），这两者的目标。我们评估了诱导脑出血后神经功能的赤字和脑水肿24和72小时。脑内注射自体血液（30微升）或细菌胶原酶（0.075U）造成重现性神经功能缺损的小鼠，在24显着增加脑水肿和手术后72小时（对<0.05）。总之，这两种模式产生一致的出血性梗死和代表进行临床前的非物质文化遗产研究的基本方法。

Protocol

所有的程序进行，符合美国国立卫生研究院指南实验动物护理和使用的 Loma Linda大学的动物管理和使用委员会的批准。

1。术前准备工作

无菌操作技术，被推荐用于所有的外科手术。立体定向设备消毒和手术前准备无菌手术工具。在所有的动物处理佩戴个人防护装备（PPE）。在手术过程中使用的加热垫，以保持动物的生理体温。

1. 称量8-12周龄小鼠使用三束动物规模的。
2. 合作注入氯胺酮（100毫克/千克）和甲苯噻嗪（10毫克/千克）腹腔注射的麻醉7-10分钟才能生效（显示器足够的镇静）。
3. 将鼠标放置在一个热毯上，剃​​的头皮。
4. 眼膏的双眼。
5. 固定气道，轻轻地移动舌头侧面，并小心地保护鼠标的头部立体定向设备上。注意：头必须确保立体定向帧的基础水平。
6. 消毒手术区域用聚维酮碘，并用70％乙醇冲洗。重复交替应用的聚维酮碘和70％乙醇为共三次。棉签喷头可以用于此目的。

2。注血模型

1. 一个1厘米长的中线切开头皮＃10手术刀。
2. 使用棉签涂抹，以清除覆盖在颅骨的软组织，以暴露的垂直交叉点的冠状面和矢状缝（前囟门）。
3. Hamilton注射器（250微升）安装到注射泵上，和立体定向指示针（26表压）超过前囟。
4. 接下来，调整立体机械臂，定位针0.2毫米前和2毫米横向右侧。在这些坐标上使一个小的颅骨钻孔，使用变速1毫米的钻头钻。
5. 挂起动物的尾巴，并用70％乙醇消毒其下表面。
6. 尾动脉穿刺中央，用无菌针（ 如 26号）和收集动脉血毛细管的unheparinized管。
7. 转移的血很快从毛细管的Hamilton注射器的玻璃针管，然后将柱塞。
8. 现在30μl以上动脉的血液中含有Hamilton注射器的注射泵上重新连接和插入针（其斜角边缘朝向矢状缝）通过钻孔，，只是直到其锥不再可见。
9. 从这个角度提前针3毫米腹侧和2微升/分钟的速率注入5μl的自体血。
10. 结束后的第一注射预先针0.7毫米进一步深入。
11. 等待5分钟，然后注入25微升的血液进入右侧纹状体。
12. 完成后的第二次注射，在额外的10分钟的位置，离开针之前撤回在1毫米/分钟的速率。
13. 钻孔用骨蜡封，缝合皮肤。
14. 术后镇痛，注入0.05毫克/千克，丁丙诺啡皮下预温液（生理盐水）。

3。注射胶原酶型号

1. 经术前准备后，重复步骤1-4所描述的血液注入模型。
2. 填补Hamilton注射器（10微升）与细菌（梭菌）胶原酶VII-S溶解在0.5微升的生理盐水0.075U。避免形成气泡。
3. 重新连接到注射泵，微量注射器插入针（26号），通过钻孔，直到它的伞是不再可见。
4. 推进针3.7毫米，腹部和胶原酶注入0.075U我置身2μl/ min的速率在右侧纹状体。
5. 注射完成后，在额外的10分钟的位置，离开针之前撤回在1毫米/分钟的速率。
6. 钻孔用骨蜡封，缝合皮肤。
7. 注入0.05毫克/千克的丁丙诺啡皮下预先温热的手术后的流体。

4。假手术

1. 经术前准备后，重复步骤1-4所描述的血液注入模型。
2. 腹侧通过钻孔将针头（26号）3.7毫米。针应保持在10分钟的位置之前被在1毫米/分钟的速率排出。
3. 钻孔用骨蜡封，缝合皮肤。
4. 注入0.05毫克/千克的丁丙诺啡皮下预先温热的手术后的流体。

5。代表性的成果

实验性脑内出血唤起形态为以及在啮齿类动物的行为变化。这些变化可以进行评估，以确保有足够的执行过程，或调查的潜在治疗效果。生成区（ 例如基底节）有针对性的脑出血，是最重要的可重现的方法，并且可以对毛或组织学染色的脑切片（ 图1-2）验证。损伤的基底节感觉赤字，它可以通过各种行为评估量化结果。的拐角转弯测试结果表明，实验右路ICH后，小鼠转身显着更经常从受损的对侧（左）侧同侧和离开，比假手术组动物在手术后的24小时和72小时（ 图3 A）。此外，能够充分减值（左）前肢放置的表面上后，触须刺激，通过前肢放置试验评价。在手术后24小时和72小时，小鼠子遭离弃右路ICH均显着高于假手术动物存款减少。测量脑水肿经常采用量化的实验性脑出血后的脑损伤程度。导致脑组织含水量在同侧皮质和基底神经节在24显著增加（ 图4 A）和72小时（ 图4）手术后的脑注射自体血（30μL）或细菌胶原酶（0.075 U）（而假）。的行为测试（ 图3）和脑水肿的程度（ 图4）的结果表明在给定体积的血液和注射胶原酶模型之间没有区别。

图1。建模ICH（A）的冠状脑切片0.2毫米前的前囟门的简化原理图说明了公关的作用。oposed自体输血或注射胶原酶的位置。侧脑室标记LV。 CPu区代表尾状核，纹状体的一部分，并GP标识苍白球。两者，以及纹状体苍白球属于子皮质核的基团，也被称为基底节​​。 （B）代表的冠状脑切片0.2毫米前囟后纹状体内注射自体全血，在24小时的显微照片。

图2。组织学表现的血肿。代表苏木精伊红（H＆E）染色小鼠脑冠状冰冻切片（10微米），说明血肿大小在24小时后纹状体内注射胶原酶的细菌（0.075 U）。 LH =左侧大脑半球，RH =右半球。

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图3。在小鼠实验性脑出血后神经功能评估。，脑内注射自体血（30μL）或细菌胶原酶（0.075 U）引起的重现性神经功能障碍。 （A）小鼠实验性脑出血后表现出明显更合适的匝数比假手术组动物在手术后24小时和72小时。 （B）的前爪配售能力的左侧肢体受损脑出血后，在手术后24小时和72小时。值表示为平均值±标准差，采用Kruskal-Wallis单向方差分析排名，其次是学生Newman-Keuls法进行分析。 AP值<0.05为差异有统计学意义，N = 6-12元组，P <0.05相比，假的。 点击这里查看大图 。

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图4。在小鼠实验性脑出血后的脑组织含水量。评价自体血脑内注射（30μL）或的细菌胶原酶（0.075 U）导致显着增加脑组织含水量在同侧皮质和基底神经节在24（A）和72小时（B）在ICH-感应。值表示为平均值±标准差，单程方差分析，Tukey事后测试与分析。 AP值<0.05为差异有统计学意义，N = 6-10元组，P <0.05相比，假的。 点击这里查看大图 。

Discussion

动物模型的脑出血（ICH）做出了巨大贡献深入的了解疾病的病理生理学，以及常用的开发和评估新的治疗策略在临床前的设置。实质内注射自体血或细菌胶原酶的产生ICH在啮齿类动物中的行之有效的方法。这两种方法在大鼠最初开发，但是，由于转基因和基因敲除菌株的迅速增加的可用性，小鼠成为必不可少的，以进一步阐明出血性脑损伤的机制^8。

在人类中，基底节区脑出血占约50％的出血性中风，患者存活最初的事件经常发生，有害的神经功能障碍。因此，在啮齿类动物实验性脑出血，累及基底节，唤起动物的对侧肢体感觉赤字。对迄今为止，已经开发了几个行为评估表征这些损伤的小鼠和大鼠^9,10。

在本研究中，我们描述和评价的改性双注入模型，自体全血^6，以及一个ICH注入模型的细菌胶原酶^7，两个定位在小鼠的基底节（文集纹状体）。我们评估经由转角转弯和前肢放置试验^9,11行为缺陷，并在手术后24小时和72小时（ 图3）在两个模型观察感觉损伤增加。在这些时间点，ICH组之间没有显着差异，然而，以前的研究认为，长期损伤的进展胶原酶注射后，长期结果的研究更合适的模型，。脑水肿（脑含水量）使用的wet-weight/dry-weight的方法，如之前报道^12,13。我们的研究结果显示，血肿周围脑水肿显着增加诱导脑出血后24小时和72小时（ 图4）。小鼠实验性脑出血或假手术幸存下来，直到一天的牺牲（死亡= 0％）。

两个脑出血模型，采用了立体定向辅助手术，以确保精确和可重复的有针对性的大脑区域的血液或胶原酶注射。达到这个目的需要一个小的开颅手术（1毫米钻孔）。它是必不可少的，以避免由钻头穿孔硬脑膜，由于这种不准确性会加剧在回流的血液或胶原酶在注射过程中的损伤和结果。

最初，作为一个单一的脑内注射¹⁴开发的血液注入模型中，但它常常产生了不一致的结果由于回流的血液沿针道^15。为了尽量减少这种并发症，双注射方法，在其中一个小的量的血液被注入的正上方的目标的脑区，随后由第二次注射的血液进入基底节^6。凝固的血的第一次注射，防止沿针道的逆流。此模型模仿一个迅速发展的血肿，但不引起实际的脑血管破裂。自体血注入模型的一个主要优点是，没有混杂因素，如外源蛋白，用于诱发脑出血。另外，细菌胶原酶模型的模仿自发性脑出血，开发了几个小时，展出约30％的脑出血患者^5。细菌胶原酶是一种蛋白酶，溶解毛细血管周围的脑细胞外基质，削弱他们，引起容器破裂和随之而来的血液外渗^16。这种模式一般用于调查血肿扩大的机制以及发展前景香港专业教育学院的治疗方法，影响平衡。然而，细菌胶原酶，可以放大的炎症反应，并呈现在高剂量的神经毒性作用^3。此外，大量的出血，脑内注射胶原酶后，可能会产生 - 人类非物质文化遗产病理缺血性脑损伤。

有趣的是，雌性小鼠进行实验性脑出血神经功能缺损表现出显着更快的恢复比雄性动物^8。类似的研究结果已在缺血性中风模型，因此，雄性啮齿动物更普遍采用的研究中风的病理和治疗评价^17。

在这些实验中，我们利用腹膜内注射的麻醉药氯胺酮（100毫克/千克）和甲苯噻嗪（10毫克/公斤）两个ICH车型;然而，以前的研究已经报道了在麻醉啮齿动物的急性高血糖发病率，20内开始分钟在ketamine和甲苯噻嗪注射液^18。此外，氯胺酮，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂，可能会减少NMDA受体依赖性的兴奋性毒性，因此，改善脑损伤模型中的结果。挥发性麻醉剂交替使用，如异氟醚，在ICH临床前研究和注射剂的独特优势，包括快速改变的麻醉深度和短的恢复时间^19。气体麻醉的主要缺点是需要精心制作的设备（蒸发器，流量计，掩模呼吸回路），以及人类气体暴露的可能性。此外，异氟醚已被报道，以减少出血性卒中后在小鼠²⁰细胞凋亡。需要适应的最佳麻醉取决于长度的手术，动物种或菌株，和感兴趣的结果测量。

我们在描述和演示了两个脑出血模型，有尹居良优势和弱点，而代表特定的ICH性能的。必须考虑每个模型的典型特征，用于临床前ICH调查时。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic Head Frame	Stoelting Co.	51600
Nanomite Syringe Pump	Harvard Apparatus	PY2 70-2217
Hamilton Syringe	Hamilton Company	1725RN (250 μl) 1701 RN (10 μl)	26 Gauge needle for 250 μl and 10 μl syringes.
Microdrill	Fine Science Tools	18000-17
Microdrill burr	Fine Science Tools	19007-09	0.9 mm diameter
Collagenase Type VII-S	Sigma-Aldrich	C2399
Microhematocrit Capillary Tubes	Fisher Scientific	22-362-574	unheparinized
Bone Wax	Ethicon	W31
Suture	Ethicon	1676G
Ketamine	JHP Pharmaceuticals	42023-115-10	Ketalar
Xylazine	LLOYD Laboratories	139-236	AnaSed