Visualización de las bacterias en los nematodos mediante microscopía de fluorescencia

Resumen

Para estudiar el mutualismo entre Xenorhabdus Bacterias y Steinernema, se han desarrollado métodos para monitorizar la presencia bacteriana y la ubicación dentro de los nematodos. El enfoque experimental, que se puede aplicar a otros sistemas, implica bacterias de ingeniería para expresar la proteína verde fluorescente y la visualización, utilizando bacterias de microscopía de fluorescencia dentro del nematodo transparente.

Resumen

Simbiosis, la convivencia de dos o más organismos, se han generalizado en todos los reinos de la vida. Como dos de los organismos más ubicuos en la tierra, nematodos y bacterias formar una amplia variedad de asociaciones simbióticas que van desde beneficioso para patógena ^1-3. Una de estas asociaciones es la relación de beneficio mutuo entre las bacterias y nematodos Steinernema Xenorhabdus, que ha surgido como un sistema modelo de simbiosis ^4. Nematodos entomopatógenos Steinernema son, con su simbionte bacteriano para matar insectos ^5. Para la transmisión entre huéspedes de insectos, las bacterias colonizan el intestino de la etapa del nemátodo infectivo juvenil ^6-8. Recientemente, varias otras especies de nematodos se ha demostrado que las bacterias utilizan para matar insectos ^9-13, y las investigaciones han comenzado a examinar las interacciones entre los nematodos y bacterias en estos sistemas <sup> 9.

Se describe un método para la visualización de un simbionte bacteriano dentro de o en un host nematodo, tomando ventaja de la transparencia óptica de los nematodos cuando se vieron por microscopía. Las bacterias se han diseñado para expresar una proteína fluorescente, lo que permite su visualización por microscopía de fluorescencia. Se dispone de muchos plásmidos que llevan los genes que codifican proteínas que presentan fluorescencia a longitudes de onda diferentes (es decir, verde o rojo), y la conjugación de los plásmidos procedentes de una cepa de Escherichia coli donante en un receptor simbionte bacteriano tiene éxito para una amplia gama de bacterias. Los métodos descritos se han desarrollado para investigar la asociación entre Steinernema carpocapsae y Xenorhabdus nematophila ^14. Métodos similares se han utilizado para investigar otros bacteria nematodos asociaciones ^{9, 15-18} y por lo tanto, el enfoque es en general aplicable.

El METhod permite la caracterización de la presencia bacteriana y la localización dentro de los nematodos en diferentes etapas de desarrollo, y proporciona información sobre la naturaleza de la asociación y el proceso de colonización ^{14, 16, 19.} El análisis microscópico revela tanto la frecuencia de colonización dentro de una población y la localización de las bacterias a los tejidos del huésped ^{14, 16, 19-21.} Esto es una ventaja sobre otros métodos de seguimiento de las bacterias dentro de las poblaciones de nematodos, tales como sonicación ²² o molienda ^23, que puede proporcionar los niveles medios de la colonización, pero no puede, por ejemplo, discriminar poblaciones con una alta frecuencia de bajas cargas simbiontes de poblaciones con una baja frecuencia de las cargas simbiontes altas. La discriminación de la frecuencia y de la carga de bacterias colonizadoras puede ser especialmente importante en el cribado o la caracterización de mutantes bacterianos para fenotipos colonización ^{21, 24.} En efecto, la microscopía de fluorescencia se ha utilizado en el cribado de alto rendimiento de mutantes bacterianos de los defectos de colonización ^{17, 18,} ​​y es menos laborioso que otros métodos, incluyendo la sonicación ^{22, 25-27} y disección nematodos individuales ^{28, 29.}

Protocolo

1. Construcción de una cepa bacteriana fluorescente mediante conjugación

1. Crece la cepa receptora (simbionte para ser examinadas) y la cepa donante durante la noche. La cepa donante, generalmente Escherichia coli, debe ser capaz de donar ADN a través de la conjugación y deben transformarse con un. Plásmido (Tabla 2) que lleva un gen que codifica una proteína fluorescente Dependiendo del plásmido, una cepa auxiliar conjugación también puede ser necesaria. Si es así, esta cepa también se cultivaron durante la noche. La cepa donante y la tensión auxiliar debería ser cultivadas con antibióticos para seleccionar para el mantenimiento de....

Discusión

El protocolo aquí descrito proporciona un método para la detección óptica de las bacterias dentro de un huésped nematodo (Figura 1). Este método tiene la ventaja de la transparencia óptica de los nematodos y la capacidad de las bacterias de etiquetas fluorescentemente, lo que permite el análisis in vivo de las bacterias dentro del huésped nemátodo (Figura 3). En concreto, este enfoque identifica la localización de bacterias dentro de su huésped. Al contar una población.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Lípidos Agar (Estéril)			8 gramos de caldo nutriente, 15 gramos de agar de extracto de levadura, 5 gramos, 890 ml de agua, 10 ml de 0,2 g / ml de MgCl 2. 6 H 2 0, 96 ml de jarabe de maíz solución *, 4 ml de aceite de maíz * Revuelva los medios de comunicación mientras se vierte placas * Añadir ingrediente estéril después del autoclavado
Solución de jarabe de maíz (Estéril)			7 ml de jarabe de maíz, 89 ml de agua mezcla y autoclave
Huevo Solution			16,6 ml de sodio 12% de hipoclorito, 5 ml de KOH 5 M, 80 ml de agua
Lisogenia Caldo (Estéril)			5 gramos de extracto de levadura, 10 g de triptona, 5 gramos de sal, 1 l de agua mezcla y autoclave
Microcentrifugue	Pescador	13-100-675	Cualquier microcentrífuga que contiene tubos de microcentrífuga funcionará
Centrífugo	Beckman	366802	Gran mesa centrífuga superior que posee el 15 ml y 50 ml tubos cónicos
Estéril 60 mm X 15 mm Petri Dish	Pescador	0875713
50 ml tubos de centrífuga	Pescador	05-539-6
15 ml tubos de centrífuga	Pescador	05-531-6
Estéril 100 mm X 20 mm Petri Dish	Pescador	0875711Z	Más profundo que el estándar de placas de Petri
24-así placa	Greiner Bio-One	662000-06
Microscopio			El microscopio tiene capacidad fluorescentes compatibles con el fluoróforo
Paraformaldehído	Microscopía Electrónica de Ciencias	15710
PBS (Estéril)			8 g de NaCl 0,2 g de KCl 1,44 g de Na 2 HPO 4 0,24 g de KH 2 PO 4 1 L de agua Ajuste a un pH de 7,4 y agua a 1 L y autoclave
Tubos de microcentrífuga	Pescador	05-408-138	2 ml o 1,5 ml tubos
Shaker			Cualquier agitador que hace que el líquido se mueva suavemente funcionará
Ácido diaminopimélico	Sigma	D-1377	Si es necesario, suplementar medios a una concentración de 1 mM o