La biosíntesis heteróloga de la eritromicina A través E. coli Incluye las siguientes etapas experimentales: 1) la transferencia genética, 2) la reconstitución heteróloga, y 3) análisis de productos. Cada paso se explica en el contexto de la motivación, el potencial y retos terapéuticos en la producción de productos naturales utilizando E. coli Como anfitrión sustituto.
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Artículo de método
La lógica, la Plaza experimentales, y el potencial de la Biosíntesis heteróloga Producto Natural Con la eritromicina Complejo antibiótico producido a través de un
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Resumen
Resumen
La producción heteróloga de productos naturales complejos es un enfoque diseñado para hacer frente a las limitaciones actuales y las posibilidades futuras. Es particularmente útil para aquellos compuestos que poseen valor terapéutico, pero no puede ser suficientemente producido o se beneficiaría de una forma mejorada de producción. Los procedimientos experimentales implicados pueden subdividirse en tres componentes: 1) transferencia genética, 2) la reconstitución heterólogo, y 3) el análisis del producto. Cada componente experimental está en continua optimización para afrontar los retos y anticipar las oportunidades asociadas a este nuevo enfoque.
Heteróloga biosíntesis comienza con la identificación de una secuencia genética responsable de un producto natural valioso. La transferencia de esta secuencia a un huésped heterólogo se ve complicada por la complejidad ruta biosintética responsable de la formación de producto. El antibiótico eritromicina A es un buen ejemplo. Veinte genes (un total de> 50 kb) son necesarias para la biosíntesis eventual. Además, tres de estos genes codifican megasynthases, multi-dominio de enzimas cada ~ 300 kDa de tamaño. Este material genético debe ser diseñado y se transfirió a E. coli para la biosíntesis reconstituida. El uso de aislamiento de PCR, construcción operón, plásmidos de múltiples cystronic, y electro-transformación se describe en la transferencia de la eritromicina A clúster genética a E. coli.
Una vez transferido, el E. coli celular debe soportar la biosíntesis eventual. Este proceso es también un reto, dadas las diferencias sustanciales entre E. coli y la mayoría de los anfitriones originales responsables de la formación de complejos productos naturales. La celda debe proporcionar sustratos necesarios para apoyar la biosíntesis y coordinadamente expresar el cluster genético transferido para producir enzimas activas. En el caso de la eritromicina A, la E. coli celular tuvo que ser diseñado para proporcionar a los dos precursores (propionyl-CoA y (2S)-metilmalonil-CoA) necesario para la biosíntesis. Además, las modificaciones de secuencias de genes, el número de copias del plásmido, chaperonina co-expresión, modificación post-traduccional enzimática, y temperatura de proceso se requiere también para permitir que la eritromicina A final de formación.
Por último, la producción exitosa debe ser evaluada. Para el caso de la eritromicina A, presentaremos dos métodos. La primera es la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) para confirmar y cuantificar la producción. La bioactividad de la eritromicina A también se confirmó mediante el uso de un ensayo biológico en el que se prueba la actividad antibiótica contra Bacillus subtilis. Los ensayos de evaluación establecen eritromicina A de la biosíntesis de E. coli y sentar las bases para futuros esfuerzos de ingeniería para mejorar o diversificar la producción y para la producción de nuevos compuestos complejos naturales utilizando este enfoque.
Introducción
Eritromicina A es un antibiótico producido por el policétido Gram-positivos bacteria del suelo Saccharopolyspora erythraea, y la producción actual se ha mejorado incrementalmente a ~ 10 g / L a través de décadas de mutagénesis tradicional y protocolos de cribado y más recientemente a través de esquemas de optimización de proceso 1-6. Estrategias de mutagénesis y selección son comunes en el desarrollo de antibióticos producto natural como resultado de las dificultades de cultivo y / o la manipulación genética de huéspedes nativos de producción y debido a la actividad antibiótica fácilmente disponibles o fenotipos de crecimiento mejoradas para facil....
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Protocolo
El texto siguiente es específico para el antibiótico eritromicina A, pero los pasos están diseñados para ser aplicables a otros productos naturales como candidatos para la biosíntesis heterólogo.
1. Eritromicina A Transferencia Genética Cluster
- Diseñar cebadores de PCR para amplificar todos los genes asociados con la eritromicina A en el grupo S. erythraea cromosoma. Este paso es específica para los candidatos de productos naturales cuyas secuencias genéticas se han determinado. Alternativamente, los genes requeridos pueden ser sintetizados (a través de varias opciones de proveedor comercial) con la ventaja de que los ....
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Resultados
El resultado deseado de este enfoque es la producción de un producto natural completamente bioactivo a partir de la E. coli heteróloga de acogida. Esto está mejor representada por los resultados de CL-EM utilizados para confirmar y cuantificar la producción (Figura 6) y el bioensayo antibacteriano utilizado para confirmar la actividad final (Figura 7). En el esquema general de la biosíntesis heteróloga, este resultado se define el éxito. Una vez logrado, los esfuerzos de invest.......
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Discusión
Los pasos críticos en la biosíntesis heteróloga se encuentran en cada uno de los tres puntos de procedimiento en el proceso: 1) la transferencia genética, 2) la reconstitución de biosíntesis, y 3) análisis del producto. Un problema en cualquier momento va a descarrilar el objetivo último de establecer la biosíntesis heteróloga. Tal vez el aspecto más difícil del proceso es el establecimiento de la biosíntesis reconstituida, ya que esto es absolutamente necesario para permitir un análisis acertado. Sin embargo, la recons.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Los autores agradecen al NIH (AI074224 y GM085323) y NSF (0712019 y 0924699) fondos para apoyar proyectos dedicados a la biosíntesis heteróloga.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| PCR máquina | Eppendorf | Mastercycler personal | |
| Sulfóxido de dimetilo (DMSO) | Pescador | BP231 | |
| Electroporador | BioRad | Micropulser | |
| IPTG | Pescador | BP1620 | |
| Propionato de sodio | Sigma | P1880 | |
| L-arabinosa | Sigma | A3256 | |
| Refrigerado Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
| Microcentrifugue | Eppendorf | Centrifugar 5415D | |
| pGro7 | Takara | Acompañante plásmido Set (3340) | |
| pET21, pET28, PCDF-Duet-1 | Merck Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
| LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
| Acetato de etilo | Sigma | 270989 | |
| Metanol | Sigma | 322415 | |
| Centrífuga de vacío | Eppendorf | Concentrador de 5301 | |
| Evaporador rotativo | Buchi | R-200 |
Referencias
- Adrio, J. L., Demain, A. L. Genetic improvement of processes yielding microbial products. FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).
- Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Genetic engineering of ....
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Reimpresiones y permisos
