La biosíntesis heteróloga de la eritromicina A través E. coli Incluye las siguientes etapas experimentales: 1) la transferencia genética, 2) la reconstitución heteróloga, y 3) análisis de productos. Cada paso se explica en el contexto de la motivación, el potencial y retos terapéuticos en la producción de productos naturales utilizando E. coli Como anfitrión sustituto.
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Artículo de método
La lógica, la Plaza experimentales, y el potencial de la Biosíntesis heteróloga Producto Natural Con la eritromicina Complejo antibiótico producido a través de un
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Resumen
Resumen
La producción heteróloga de productos naturales complejos es un enfoque diseñado para hacer frente a las limitaciones actuales y las posibilidades futuras. Es particularmente útil para aquellos compuestos que poseen valor terapéutico, pero no puede ser suficientemente producido o se beneficiaría de una forma mejorada de producción. Los procedimientos experimentales implicados pueden subdividirse en tres componentes: 1) transferencia genética, 2) la reconstitución heterólogo, y 3) el análisis del producto. Cada componente experimental está en continua optimización para afrontar los retos y anticipar las oportunidades asociadas a este nuevo enfoque.
Heteróloga biosíntesis comienza con la identificación de una secuencia genética responsable de un producto natural valioso. La transferencia de esta secuencia a un huésped heterólogo se ve complicada por la complejidad ruta biosintética responsable de la formación de producto. El antibiótico eritromicina A es un buen ejemplo. Veinte genes (un total de> 50 kb) son necesarias para la biosíntesis eventual. Además, tres de estos genes codifican megasynthases, multi-dominio de enzimas cada ~ 300 kDa de tamaño. Este material genético debe ser diseñado y se transfirió a E. coli para la biosíntesis reconstituida. El uso de aislamiento de PCR, construcción operón, plásmidos de múltiples cystronic, y electro-transformación se describe en la transferencia de la eritromicina A clúster genética a E. coli.
Una vez transferido, el E. coli celular debe soportar la biosíntesis eventual. Este proceso es también un reto, dadas las diferencias sustanciales entre E. coli y la mayoría de los anfitriones originales responsables de la formación de complejos productos naturales. La celda debe proporcionar sustratos necesarios para apoyar la biosíntesis y coordinadamente expresar el cluster genético transferido para producir enzimas activas. En el caso de la eritromicina A, la E. coli celular tuvo que ser diseñado para proporcionar a los dos precursores (propionyl-CoA y (2S)-metilmalonil-CoA) necesario para la biosíntesis. Además, las modificaciones de secuencias de genes, el número de copias del plásmido, chaperonina co-expresión, modificación post-traduccional enzimática, y temperatura de proceso se requiere también para permitir que la eritromicina A final de formación.
Por último, la producción exitosa debe ser evaluada. Para el caso de la eritromicina A, presentaremos dos métodos. La primera es la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) para confirmar y cuantificar la producción. La bioactividad de la eritromicina A también se confirmó mediante el uso de un ensayo biológico en el que se prueba la actividad antibiótica contra Bacillus subtilis. Los ensayos de evaluación establecen eritromicina A de la biosíntesis de E. coli y sentar las bases para futuros esfuerzos de ingeniería para mejorar o diversificar la producción y para la producción de nuevos compuestos complejos naturales utilizando este enfoque.
Introducción
Eritromicina A es un antibiótico producido por el policétido Gram-positivos bacteria del suelo Saccharopolyspora erythraea, y la producción actual se ha mejorado incrementalmente a ~ 10 g / L a través de décadas de mutagénesis tradicional y protocolos de cribado y más recientemente a través de esquemas de optimización de proceso 1-6. Estrategias de mutagénesis y selección son comunes en el desarrollo de antibióticos producto natural como resultado de las dificultades de cultivo y / o la manipulación genética de huéspedes nativos de producción y debido a la actividad antibiótica fácilmente disponibles o fenotipos de crecimiento mejoradas para facilitar la selección. En el caso de la eritromicina A, S. erythraea está limitado por un perfil de crecimiento lento y la falta de técnicas de manipulación genética directa (con relación a organismos tales como E. coli), por lo tanto, lo que dificulta una rápida mejora de la producción y la biosíntesis de nuevos derivados. Habiendo reconocido los problemas de producción y desbloqueado diversificatisobre las posibilidades con compuestos como la eritromicina A, la comunidad de investigadores comenzó a perseguir la idea de la biosíntesis heteróloga (Figura 1) 7. Estos esfuerzos coincidieron con la información secuencial disponible para el grupo de genes de eritromicina A 8-11. Cabe destacar que el número de secuenciado los complejos grupos de productos naturales de genes ha ampliado en gran medida 12-16, para proporcionar el empuje para mantener los esfuerzos en la biosíntesis heteróloga de acceso codificado potencial medicinal. Para ello, la reconstitución heterólogo requiere que el nuevo huésped satisfacer las necesidades de la ruta biosintética específica. E. coli proporciona la conveniencia técnica, un amplio abanico que abarca las técnicas de biología molecular y estrategias metabólicas y procesos de ingeniería para desarrollo de productos. Sin embargo, cuando se compara con los hosts de producción nativos, E. coli no presenta el mismo nivel de producción complejo producto natural. Por lo tanto, se desconoce si E. coli podría servir como una opción viable para la biosíntesis de complejo heterólogo producto natural. Sin embargo, se supuso que la E. coli sería un organismo huésped ideal si biosíntesis heterólogo podría ser lograda.
Con este objetivo en mente, los esfuerzos iniciales comenzaron a producir la aglicona policétido 6-desoxieritronolida B (6dEB) a través de E. coli. Sin embargo, nativo E. metabolismo coli no podría proporcionar niveles apreciables de la propionil-CoA y (2S)-metilmalonil-CoA precursores necesarios para apoyar la biosíntesis de 6dEB ni podía el nuevo huésped después de la traducción modificar la sintasa B desoxieritronolida (DEBS) enzimas. Para solucionar estos problemas, una vía metabólica compuesto de enzimas nativas y heterólogas fue construido en E. coli tales que exógenamente propionato alimentado se convierte intracelularmente propionil-CoA y luego (2S)-metilmalonil-CoA; durante la ingeniería para completar esta vía, un gen sfp se colocó en the cromosoma de E. coli BL21 (DE3) para producir una nueva cepa llamada BAP1. La enzima Sfp es un capaz phosphopantetheinyl transferasa de unir el cofactor 4'-fosfopanteteína a las enzimas DEBS 17,18. Los tres genes DEBS (cada ~ 10 kb) se colocaron después en dos vectores de expresión por separado seleccionables que contienen promotores inducibles T7. Después de un ajuste de clave de temperatura después de la inducción (a 22 ° C), los genes DEBS fueron expresados coordinadamente dentro BAP1 en un estado activo capaz de generar 6dEB 19.
La búsqueda de la eritromicina A plena biosíntesis entonces comenzó a usar un grupo de genes análogos de Micromonospora megalomicea o una vía híbrida compuesta de genes de S. erythraea, S. fradiae, y S. venezuelae, que produce los compuestos intermedios eritromicina C y D 6-desoxieritromicina, respectivamente 20-22. Recientemente, nuestro grupo ha extendido estos esfuerzos mediante la producción de erythromycin A (la forma más clínicamente pertinente de la eritromicina) a través de E. coli. A diferencia de los trabajos anteriores, nuestra estrategia coordinada expresó la S. 20 original erythraea genes necesarios para la biosíntesis de policétidos, la biosíntesis de deoxysugar y fijación, corte y confección adicional, y auto-resistencia (Figura 2). En total, 26 (nativo y heterólogas) genes fueron diseñados para permitir a E. coli para producir eritromicina A en 4 mg / L 23,24. Este resultado estableció la producción completa de un complejo producto natural policétido utilizando E. coli y sirve como base para aprovechar esta opción de nueva producción o el ejercicio de otras nuevas.
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Protocolo
El texto siguiente es específico para el antibiótico eritromicina A, pero los pasos están diseñados para ser aplicables a otros productos naturales como candidatos para la biosíntesis heterólogo.
1. Eritromicina A Transferencia Genética Cluster
- Diseñar cebadores de PCR para amplificar todos los genes asociados con la eritromicina A en el grupo S. erythraea cromosoma. Este paso es específica para los candidatos de productos naturales cuyas secuencias genéticas se han determinado. Alternativamente, los genes requeridos pueden ser sintetizados (a través de varias opciones de proveedor comercial) con la ventaja de que los genes recientemente sintetizados estaría diseñado para el uso de codones óptima dentro de la E. nuevo coli huésped. Si la síntesis de ADN se persigue, un desafío actual es la generación de genes megasynthase que pueden exceder de 10 kb de longitud. Técnicamente, la síntesis se puede lograr, pero es difícil y costoso. Se prevé que improvem continuopadres en la tecnología genética síntesis abordará inconvenientes actuales y validan aún más este enfoque para el suministro de material genético heterólogo.
- Realizar PCR usando recién preparada S. erythraea ADN genómico como plantilla. El ADN cromosómico se pueden preparar a partir de cultivos de S. erythraea o de material congelado de la bacteria (Figura 3) 25. Las reacciones de PCR se pueden beneficiar de la adición de DMSO (4 l en reacciones de 50 l) para dar cuenta de alto contenido de G + C en el objetivo S. erythraea genes. Cada gen amplificado se secuenció para confirmar que el gen completo ha sido recuperado y que no se han introducido mutaciones durante el proceso de PCR.
- Mediante digestión de restricción y ligación, insertar cada uno de los genes aislados en vectores de expresión diseñados para E. coli (Figura 3). Esta es iniciada por el diseño de sitios de restricción dentro de los cebadores de PCR para permitir la digestión y ligación en ex adecuadovectores de depresión (un ejemplo se ha incluido en la figura 3). Hemos utilizado tanto pET21 y vectores pET28. El vector pET28 permite la inclusión de una secuencia líder 5 ', que ayuda en la expresión de genes de eritromicina un caso. Confirmar la expresión de genes individuales a través de RT-PCR, análisis SDS-PAGE (usando fracciones de proteínas solubles), o convenientes ensayos fenotípicos (Figura 4).
- Construir operones basados en genes expresados con éxito a partir de plásmidos de expresión individuales (Figura 3). Hemos utilizado tradicionalmente combinaciones de enzimas de restricción compatible-cohesivos (tal como Xba I y Spe I) 24 para convertir secuencialmente genes para los operones, sin embargo, los sitios de restricción elegido para la construcción operón no debe residir dentro de (o debe ser retirado de) el aislado secuencias de genes (un problema que se puede evitar si se utiliza la síntesis de genes). Este paso consolida la eritromicina A 20 genes antes de la E. coli transformación. Actualmente, hemos utilizado este método para incluir hasta 20 kb de ADN extraño en un vector pET estándar (dos genes de ~ 10 kb cada uno). Además, hemos utilizado este enfoque para generar operones contienen nueve genes. No se sabe exactamente la cantidad de ADN o número de genes que pueden estar integrados en pET de tipo plásmidos, sin embargo, los indicadores citados anteriormente proporcionan una referencia para los sistemas complicados como la vía biosintética de eritromicina. Finalmente, estándar en los pasos de ligación in vitro y las subsiguientes etapas de transformación con éxito cada vez más difícil como operón y aumenta plásmido tamaño. Temperatura de ligadura (12-22 ° C) y tiempo (3-24 hr) son variadas y electro-transformación se utiliza para ayudar en el proceso de producción de construcciones de plásmidos finales.
- Transformar los plásmidos biosíntesis de nuevo diseño en E. coli cepa BAP1 mediante electro-transformación (Figura 5). El procedimiento puede intentarse con plásmidos introducidos de forma secuencial o en combination. Al transformar tamaño capaz o plásmidos numerosas, que han utilizado tradicionalmente electro-transformación (en oposición a una transformación química). Una vez transformado, placa de las células sobre medio sólido LB que contenía tetraciclina (5 mg / l), carbenicilina (100 mg / l), kanamicina (50 mg / l), estreptomicina (50 mg / l), y apramicina (50 mg / l ) para seleccionar para el mantenimiento del plásmido. Es muy raro utilizar antibióticos seis selección diferente después de la transformación de una E. coli celular, pero esto simplemente refleja el número total de plásmidos necesarios para permitir la eritromicina A final de la biosíntesis. Si bien es posible, el enfoque limitará las capacidades de producción del compuesto, una vez se ha iniciado el cultivo (véase más adelante).
2. E. coli Reconstitución biosintética
- BAP1 cepa ha sido diseñado para proporcionar a los sustratos necesarios para la biosíntesis y de modificar después de la traducción la megasynthase B desoxieritronolida. Los genes individuales de la erythromycin Una vía se han probado para la expresión de genes y operones consolidado como en plásmidos de expresión. Esta sección está dedicada a las condiciones de cultivo para determinar la actividad concertada de la eritromicina A plena vía.
- Tome 3 colonias separadas de la BAP1 recién transformada y inocular cultivos de 1,5 ml de LB que contienen los antibióticos requeridos plásmido de selección (en las mismas concentraciones indicado anteriormente para seleccionar los transformantes en medio sólido), isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG; 100 mM ) y arabinosa (2 mg / ml) para inducir la expresión de genes, y propionato de sodio 20 mM para apoyar la formación intracelular precursor biosintético. Una vez que se ha confirmado la producción, cultivos más grandes pueden llevarse a cabo en un intento de aumentar y maximizar los títulos de producto.
- Cultivar las células a 22 º C y 250 rpm durante 24-48 horas. En este caso, los antibióticos de selección asegura que los plásmidos requeridos se mantienen en las primeras etapas del cultivo celular. Sin embargo, el plásmidos puede perderse fácilmente como los niveles de selección de antibióticos cambian en el transcurso del período de cultivo. Esto puede conducir a la inestabilidad del plásmido (es decir, la pérdida de uno o más plásmidos durante el cultivo), que luego podría limitar la capacidad de producción. El problema se exacerba cuando plásmidos incompatibles se utilizan para introducir un grupo completo de genes heterólogos. Tal es el caso para el compuesto de eritromicina A (Figura 5) y tendría que ser remediada a la sobreproducción verdaderamente el compuesto de E. coli. Sin embargo, para el propósito de demostrar la producción inicial, tales defectos de diseño son tolerados por el bien de expedita constitutivo de la viabilidad del enfoque heterólogo.
- Aclarar las culturas por centrifugación a 10.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf. Eliminar el sobrenadante y se almacena a 4 ° C para su análisis.
- En el caso de la eritromicina A, la falta de producción de compuesto fue tratado por la inclusión de la chaperonina GroES / EL (utilizando pGro7específicamente para hacer frente a la falta de actividad de la enzimas post-expresión) y la inclusión de copias de genes adicionales (para los genes sospechosos de expresión débil / actividad). Estrategias similares pueden ser necesarios esfuerzos con otros heterólogos de productos naturales de producción.
3. Análisis del producto
- Para confirmar y cuantificar la formación de la eritromicina A, se inyecta el sobrenadante de cultivo en un sistema de LC-MS (Figura 6). Eritromicina A disponible comercialmente se utilizó para confirmar la producción y como un estándar, durante la cuantificación. Para los casos sin estándares comercialmente disponibles, LC-MS análisis requeriría caracterización química adicional por RMN y espectrometría de masas de alta resolución.
- Comparar la producción entre las 3 colonias / culturas de la transformación BAP1. Elija el mayor productor y preparar una acción del glicerol de la fuente de colonia. Este paso se puede realizar en paralelo con los cultivos de producción de la sección Protocolo2 mediante el uso de una pequeña porción de los cultivos para preparar stocks de glicerol. Almacene la acción del glicerol en un congelador -80 ° C.
- Usando los confirmados, el más alto stock de células productoras, comienza una cultura de producción independiente y extraer el sobrenadante final con 2x volumen de acetato de etilo. Usar un sistema de vacío por evaporación para secar el extracto y se resuspende en 100 l de metanol. Transferir el extracto a un disco de filtro estéril (diámetro ~ 1/4 pulgada) y permitir que el disco se seque. Por otra parte, la cultura B. subtillis en líquido LB noche a la mañana. Añadir 20 l de la B. subtilis cultivo a 20 ml de agar LB líquido a 45 ° C. Placa de agar y dejar que se solidifique. Colocar el disco de filtro sobre la placa y se incuba a 37 ° C (Figura 7). Alternativamente, el extracto puede ser añadido a cultivos líquidos dentro de una placa de 96 pocillos para cuantificar la actividad usando un lector de placas (Figura 7).
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Resultados
El resultado deseado de este enfoque es la producción de un producto natural completamente bioactivo a partir de la E. coli heteróloga de acogida. Esto está mejor representada por los resultados de CL-EM utilizados para confirmar y cuantificar la producción (Figura 6) y el bioensayo antibacteriano utilizado para confirmar la actividad final (Figura 7). En el esquema general de la biosíntesis heteróloga, este resultado se define el éxito. Una vez logrado, los esfuerzos de invest...
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Discusión
Los pasos críticos en la biosíntesis heteróloga se encuentran en cada uno de los tres puntos de procedimiento en el proceso: 1) la transferencia genética, 2) la reconstitución de biosíntesis, y 3) análisis del producto. Un problema en cualquier momento va a descarrilar el objetivo último de establecer la biosíntesis heteróloga. Tal vez el aspecto más difícil del proceso es el establecimiento de la biosíntesis reconstituida, ya que esto es absolutamente necesario para permitir un análisis acertado. Sin embargo, la recons...
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Los autores agradecen al NIH (AI074224 y GM085323) y NSF (0712019 y 0924699) fondos para apoyar proyectos dedicados a la biosíntesis heteróloga.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| PCR máquina | Eppendorf | Mastercycler personal | |
| Sulfóxido de dimetilo (DMSO) | Pescador | BP231 | |
| Electroporador | BioRad | Micropulser | |
| IPTG | Pescador | BP1620 | |
| Propionato de sodio | Sigma | P1880 | |
| L-arabinosa | Sigma | A3256 | |
| Refrigerado Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
| Microcentrifugue | Eppendorf | Centrifugar 5415D | |
| pGro7 | Takara | Acompañante plásmido Set (3340) | |
| pET21, pET28, PCDF-Duet-1 | Merck Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
| LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
| Acetato de etilo | Sigma | 270989 | |
| Metanol | Sigma | 322415 | |
| Centrífuga de vacío | Eppendorf | Concentrador de 5301 | |
| Evaporador rotativo | Buchi | R-200 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
