Artículo de método

Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en Drosophila

DOI:

10.3791/4355

⸱

4 de diciembre de 2012

 ,  , 
1Center for Sleep and Circadian Neurobiology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Para comprender un enlace entre la respuesta inmunitaria y el comportamiento, se describe un método para medir el comportamiento locomotor en Drosophila Durante la infección bacteriana, así como la habilidad de las moscas para montar una respuesta inmune por la supervivencia de seguimiento, la carga bacteriana, y en tiempo real de la actividad de un regulador clave de la inmunidad innata, NFkB.

Resumen

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Una compleja interacción entre la respuesta inmunitaria y el comportamiento del sistema se ha descrito en una amplia gama de especies. Exceso de sueño, en particular, se sabe que ocurre como respuesta a la infección en mamíferos 1 y también ha sido descrito recientemente en Drosophila melanogaster 2. En general se acepta que el sueño es beneficiosa para el huésped durante una infección y que es importante para el mantenimiento de un sistema inmune robusto 3,4. Sin embargo, la evidencia experimental que apoya esta hipótesis es limitada 4, y la función de exceso de sueño durante una respuesta inmune sigue siendo poco clara. Hemos utilizado un enfoque multidisciplinario para abordar este complejo problema, y se han llevado a cabo estudios en el sistema modelo genético simple, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Nosotros utilizamos un ensayo estándar para medir el comportamiento locomotor y el sueño en las moscas, y demostrar cómo este ensayo se utiliza para medir el comportamiento en las moscas infected con una cepa patógena de las bacterias. Este ensayo también es útil para controlar la duración de la supervivencia de las moscas individuales durante una infección. Medidas adicionales de la función inmune incluyen la habilidad de las moscas para eliminar una infección y la activación de NF-kB, un factor de transcripción clave que es central en la respuesta inmune innata en Drosophila. Tanto los resultados de supervivencia y el aclaramiento de bacterias durante la infección juntos son indicadores de la resistencia y la tolerancia a la infección. Resistencia se refiere a la habilidad de las moscas para eliminar una infección, mientras que la tolerancia se define como la capacidad del huésped para limitar los daños de una infección y por lo tanto sobrevivir a pesar de los altos niveles de patógenos en el sistema 5. Monitoreo en tiempo real de la actividad de NF-kB durante la infección da una idea de un mecanismo molecular de la supervivencia durante la infección. El uso de Drosophila en estos ensayos sencillos facilita los análisis genéticos y moleculares de sueñoy la respuesta inmune y cómo estos dos sistemas complejos están recíprocamente influenciados.

Protocolo

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Este protocolo utiliza dos configuraciones (Figura 1) para adquirir cuatro lecturas de datos distintas de las moscas recogidas sometidos a una infección bacteriana. Estos productos incluyen: 1) sueño / vigilia comportamiento, 2) los resultados de supervivencia, y 3) la carga bacteriana en la mosca, y 4) medición en tiempo real de la actividad de reportero NFkB en vivo. En combinación con las herramientas genéticas que están disponibles en Drosophila, estas mediciones proporcionan información mecanicista en el enlace molecular entre la función inmune y el comportamiento.

1. Medida de la actividad locomotora y del sueño en moscas

  1. La configuración utilizada para medir la actividad locomotora y dormir en moscas, que incluye la actividad de Drosophila sistema de supervisión (DAM2, Trikinetics), incubadoras, oscuro, y la preparación de los animales experimentales y los tubos de la actividad, se ha descrito previamente 6. El mismo enfoque se usa aquí, con algunas modificaciones menores.
    1. La iluminación de la incubadora está controlado por la propia incubadora. Por lo tanto, es importante sincronizar el ajuste de tiempo entre ordenador y las incubadoras.
    2. Actividad tubos se limpian para su reutilización por ebullición en una placa caliente en agua desionizada. Una pequeña cantidad de detergente es añadido para la ebullición primero, los tubos se enjuagan bien y se hirvió dos veces más. Si el hilo se utiliza para conectar el tubo, los tubos utilizados actividad (que contiene los alimentos, de cera, y los hilados de mosca) se puede limpiar sin eliminación previa del hilo.
  2. Antes de iniciar un experimento, culturas lugar que contengan tarde pupal etapas moscas en incubadoras durante tres a cuatro días para adaptarse a la iluminación experimental y otras condiciones ambientales. Luz: condiciones de oscuridad constante o se han usado comúnmente para medir el comportamiento del sueño. En este ejemplo, las moscas se aclimataron a la luz constante para eliminar la influencia del reloj circadiano en la respuesta inmune y el comportamiento 2,7,8. Como se describe en la Figura 1A , moscas de carga 1-4 días de edad en la actividad Trikinetics DAM2 monitores como se describió 6, y registro para un mínimo de tres días antes de la infección.

2. Infect moscas con una cepa patógena de las bacterias

  1. El protocolo aquí descrito es específico para S. marcescens, que son fáciles de cultivar y mantener. Protocolos para el almacenamiento a largo plazo y condiciones de cultivo para otras especies bacterianas pueden variar. S. marcescens se almacenan en 15-50% de glicerol a -80 ° C. Para prepararse para almacenamiento a largo plazo, mezclar 2 volúmenes de cultivo bacteriano durante la noche (OD 600 = 0,5 - 1,0) a 1 volumen de glicerol esterilizado en autoclave 50% en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Esto dará lugar a una concentración final de glicerol de 17%. Almacene los tubos a -80 ° C. Para preparar un corto plazo en el uso de código de bacterias, raspar el stock congelado con una punta de pipeta estéril 200 l y realizar una serie de tres vías en una placa de agar LB. Incubar la placa durante la noche a 37 & dpor ejemplo, C para obtener colonias aisladas. Guarde la placa a 4 ° C.
    Un día antes de la infección programada, recoger una única colonia de la placa de agar LB con una punta de pipeta estéril 200 l y sumergir la punta en un tubo de cultivo que contiene 5 ml de medio LB. Crecer las bacterias durante la noche, o hasta 16 horas en el interior de un agitador incubador a 37 ° C y 250 rpm hasta que se alcanza la fase de crecimiento exponencial. Medir la concentración con un espectrofotómetro a OD 600. La concentración de esta fase varía de 0,5 a 1. Si la concentración es demasiado alta, subcultivar las bacterias y crecer durante otras varias horas para conseguir una concentración óptima. Lleve a cabo el procedimiento cerca de una fuente de llama. Algunas cepas bacterianas están diseñados para resistencia a los antibióticos y se cultivan y se seleccionan para antibiótico apropiado añadir al medio. S. marcescens (ATCC # 8100) no son resistentes a los antibióticos y por lo tanto se desarrollaron en medio estéril sin antibiótico. Para verificar una técnica estéril, hacer un simulacro de culsin volver a bacterias como un control.
    La solución para infectar las moscas contiene bacterias (diluido a OD 600 = 0,1) y 1% de colorantes de alimentos (Azul Brillante FCF) en PBS. Preparar una solución de control de la inyección mediante la adición de una cantidad equivalente de medio LB utiliza en solución infección y 1% colorante azul en PBS. Store Solutions en hielo.
  2. Preparar agujas de vidrio para la inyección de las moscas. Tire capilares de vidrio (OD = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) a una punta fina usando un extractor de micropipeta (Narishige). Bajo un microscopio de disección, utilizar unas pinzas finas para romper la punta de la aguja para que la abertura sea suficientemente grande para llenar con fluido de inyección a una aspiración mediante una jeringa, pero lo suficientemente pequeño para minimizar el daño a la marcha durante el proceso de inyección. Después de romper la punta, el tamaño de la punta debe estar alrededor de 40-50 micras. La aguja de vidrio está unido a una jeringa de plástico de 3 cc con una longitud de tubería. El flujo de medio de inyección se controla manualmente aplicando presión positiva o succión con la jeringa. Evitar la contaminación del tubo de goma con inyección de fluido, como el aparato de jeringuilla se utiliza tanto para la infección y las inyecciones de control.
  3. Anestesie moscas poniéndolos en una plataforma de CO 2. CO 2 se pasa a través de un recipiente sellado de agua para humidificar la almohadilla y para reducir la electricidad estática, lo que puede complicar la manipulación de las moscas en la almohadilla. Inyectar moscas por meter la aguja de vidrio en la región por encima del escutelo del tórax dorsal. El paso del medio de inyección en la marcha se verifica por el colorante de alimentos - las moscas se vuelven azules como los spreads de alimentos para colorear través del sistema. La dosis de bacterias que reciben las moscas se pueden cuantificar como se describe en la Sección 3, a continuación. Algunos diseños experimentales incluyen un grupo de control que recibe lesión aséptico mediante la inyección de moscas con el colorante PBS y comida, pero sin bacterias.

3. Determinar la carga bacteriana

Un enfoque para evaluating de la respuesta inmune contra la infección bacteriana es determinar la infección después de la carga bacteriana. D. melanogaster es un gran modelo para determinar este parámetro porque la marcha todo se puede homogeneizar para estimar el número total de bacterias en un individuo. La lógica detrás de este protocolo es que cuando se cultivan en un medio sólido tal como caldo de Luria (LB) agar en una placa de Petri (placa de LB), una sola bacteria forma una colonia visible distinguible. Por lo tanto, por homogeneización de las moscas infectadas en medio LB líquido, generando diluciones en serie del homogeneizado, y la difusión del homogeneizado diluido en placas LB, el número de células bacterianas que infectan una mosca se puede determinar. Un grupo de control de moscas inyectadas con PBS y colorante de alimentos, pero sin las bacterias deben ser utilizados para verificar que la infección no estaba contaminado con otras especies bacterianas. No debe haber colonias en la placa de agar LB en esta condición.

  1. Autoclave todos los materiales que se utilizarán para esteprocedimiento antes de realizar la etapa de homogeneización real. Esto incluye 200 puntas de pipeta mu l cortar con tijeras, medio LB, y morteros usados ​​para la homogeneización. Preparar placas por vertido autoclave LB / agar en platos de 10 cm de Petri estériles al menos 1 día antes de homogeneizar las moscas.
  2. Anestesiar y colectar las moscas en tubos de microcentrífuga 1,5 ml y tubos Almacenar en hielo.
  3. Lleve a cabo la homogeneización cerca de una llama para evitar la contaminación. Una homogeneización de control que contiene las moscas sin infección se recomienda especialmente cuando se utiliza una cepa bacteriana, tal como S. marcescens, que no son resistentes a los antibióticos. Homogeneizar un mínimo de 2 grupos de 10 moscas por cada condición experimental. El número de moscas utilizadas por homogeneizado se determina por el experimentador. Algunos grupos han utilizado una mosca por homogeneizado, que es útil para la evaluación de la variación en la carga bacteriana entre las moscas individuales 8, mientras que otros han usado 3 a 10 moscas por homogeneizadohacer comparaciones entre genotipo o condición experimental 9-12.
    1. Añadir 400 l de medio LB a cada tubo de microcentrífuga que contiene moscas y homogeneizar utilizando un motor pequeño y mano de mortero (Kontes).
    2. Utilizando puntas de pipeta esterilizadas cortadas, serial diluir la 1:10 homogeneizado mediante la adición de 20 l LB homogeneizada / medio bacteriano a 1,5 tubo de microcentrífuga que contiene 180 l de medio LB l. Cortar las puntas de pipeta evita el bloqueo de los desechos volantes y asegura que un volumen apropiado está siendo transferido.
    3. Factor de dilución se determina empíricamente y depende del genotipo de la mosca, la cepa bacteriana utilizada, y las condiciones experimentales. Para el tipo salvaje moscas infectadas con S. marcescens, utilizar diluciones de 1:10 2 o 1:10 3 para moscas homogeneizadas inmediatamente después de la infección, y las diluciones de 1:10 o 1:10 4 5 para moscas de la homogeneizaron 24 horas después de la infección.
    4. Añadir 100 l de LB / media bacteriana del micrófonorocentrifuge tubos que contienen la dilución final y se extendió el medio en una placa de LB con bolas de vidrio (VWR) para asegurar una distribución uniforme.
    5. Deseche las bolas de vidrio en 100% de solución de EtOH. Colocar las placas de LB en una incubadora a 37 ° C durante la noche.
    6. Como un paso opcional, utilizar un sistema de formación de imágenes con luz visual para obtener una imagen de las placas LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Contar el número de colonias ya sea en la propia placa o de la imagen de la placa utilizando la herramienta de recuento en el software Photoshop (Adobe Photoshop CS3).
    7. Calcular el número de unidades formadoras de colonias por mosca usando la fórmula: [N / (N * D * v)] * V, donde n = número de colonias crecidas en la placa de LB, N = el número de las moscas agrupado en uno tubo de microcentrífuga, D = factor de dilución, y v = volumen de la solución se extendió sobre cada placa; V = volumen inicial del homogeneizado.

4. Evaluar sueño y duración de la supervivencia después de la infección

  1. Paramoscas que no se cosechan para medir la carga bacteriana, continuar el monitoreo del comportamiento durante otros 7-10 días. Duración de la supervivencia se ve influida por el genotipo de las condiciones ambientales de ventanas, y las especies bacterianas utilizado para la infección.
  2. Después de ~ 10 días, dar por terminado el experimento, descargar y procesar los datos de comportamiento como se describió previamente 6. Insomniac2 software a medida, que se basa en Matlab, se utiliza para analizar los parámetros del sueño. Es importante eliminar las moscas muertas del análisis de comportamiento. Normalmente, esto restringe el análisis a dentro del primer día después de la infección, dependiendo del tipo de infección y el genotipo mosca. Muerte en el ensayo se indica por el tiempo todos los recuentos de actividad han llegado a cero. Para facilitar el análisis de la supervivencia, Drosonex, software personalizado escrito en Microsoft Visual C + + 6.0, se utiliza para procesar archivos de datos brutos del sistema DAM Trikinetics. Los informes de software como archivos de Excel, la duración de supervivencia de cada vuelo (en horas), recoge la actividad de datuna desde todos los monitores en una sola hoja de cálculo, y notifica el porcentaje de moscas supervivientes con el tiempo establecido por el usuario. Los archivos de Excel están diseñadas para integrarse en otros paquetes de software estadístico para su posterior análisis.

5. Medir la actividad de NF-kB durante la infección utilizando un ensayo luciferase reportero

Transgenic kappa B-luc moscas utilizadas en este ensayo se generaron como se describe anteriormente en Kuo et al., 2010 2. Brevemente, el reportero kappa B-luc contiene 8 repeticiones de una secuencia de unión a NF-kB que se insertaron en un promotor aguas arriba de un marco de lectura abierto de luciferasa.

  1. Ajuste las moscas a las condiciones de luz experimentales que se describen en la sección 1.2. En este ejemplo, 1-4 días de edad * B-luc moscas están alojadas en viales que contienen una solución de sacarosa al 5%, el 2% a medio agar alimento y se coloca en luz constante (LL) durante 2 días para llegar a la misma edad de otras moscas durante la infección.
  2. Preparar una microplaca de 96 pocillos para las moscas. Cada pocillo contiene 2 capas de medio de alimentación (Figura 2), la capa superior contiene luciferina, el sustrato de la luciferasa. Añadir 300 l de un 5% de sacarosa, 2% de solución de agar a cada pocillo y dejar que se solidifique. A continuación, añadir una capa superior 50 l a cada pocillo que contenía sacarosa al 5%, 1% de agar, y 2 mM de luciferina (Gold Biotechnology, Inc.). Concentraciones luciferina utilizadas para la actividad del indicador de medida en Drosophila han variado en la literatura, y han sido tan baja como 100 mM 13. La concentración necesaria puede ser determinada empíricamente. Entre las capas de distribución de alimentos, cubrir la placa con un paño de malla fina para facilitar el secado, mientras que se mantiene la esterilidad. La placa deberá dejarse secar por completo, hasta una hora, con el fin de evitar que las moscas se queda pegada en gotas de condensación. Porque luciferina es sensible a la luz, evite exponer las placas a la luz más de lo necesario.
  3. Aplique una capa adhesiva transparente (Top-Seal-A; Perkin Elmer) a una placa de 96 pocillos de microplaca y perforar con una aguja fina en una cantidad de 2 agujeros por pocillo. Estos orificios no sólo permite el intercambio de aire a cada pocillo, sino que también proporcionan una forma para anestesiar moscas sobre una base individual. Uso de una hoja afilada y el borde recto, introducir un corte entre cada columna. Esto proporcionará una forma fácil de cargar / descargar las moscas en grupos de 8 a la vez.
    Para cargar las moscas a la microplaca, retirar los viales del incubador y moscas anestesiar a un CO 2 pad. Carga vuela uno por uno a cada pocillo columna por columna. Si una mosca sin darse cuenta se bloquea al sello adhesivo, deje volar solo, ya que a menudo son capaces de liberarse sin intervención. Devuelva la microplaca a la incubadora en LL durante 8-24 horas para adaptarse al nuevo entorno y para consumir el sustrato luciferina.
  4. Bacterias Cultura, S. marcescens, y preparar una solución para la infección como se describió anteriormente.
  5. Anestesiar tvuela con una punta de micropipeta unido a una baja presión de CO 2 líneas. Colocar la punta de la micropipeta directamente encima de los agujeros de ventilación realizados para cada pocillo. Tenga cuidado para asegurar que el CO 2 la presión es lo suficientemente alta para anestesiar a la mosca, pero suficientemente baja para evitar daños a la mosca. En grupos de ocho, individualmente transferir cada mosca a un CO 2 pad, e infectar a como se ha descrito anteriormente. Después de la infección, volveos cada una mosca a su estado original y ciérrelo bien la microplaca.
  6. Luminiscencia medida (TopCount NXT-luminiscencia y contador de centelleo; Perkin-Elmer). El contador de luminiscencia TopCount contiene un casete de apilamiento de las placas, lo que permite lecturas programadas y automatizado continuamente en incrementos deseados para cualquier periodo de tiempo (normalmente de hasta cinco días). Esta característica no está disponible en todos los instrumentos, y la recogida de datos para los experimentos realizados con otros instrumentos por lo tanto puede ser menos frecuente. El contador de luminiscencia se encuentra en un room con una temperatura controlada y programa de iluminación. Coloque los platos en la bandeja de apilamiento, apilar las placas que contienen las moscas claras entre las placas en blanco para que las moscas de recibir la luz. Programa del luminómetro de acuerdo con las especificaciones del fabricante para recoger lecturas cada hora durante un mínimo de 24 horas. En este ejemplo, los detectores están programados para leer cada pocillo durante 10 seg y se expresa el resultado como recuentos (unidades arbitrarias) por segundo. Este valor es un promedio entre 3 lecturas por pocillo. Exportar los archivos de datos a una hoja de cálculo y realizar un análisis estándar, graficando los resultados de luminiscencia.

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Resultados

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  1. La infección favorece el sueño. En este ejemplo, Canton-S (CS) moscas de tipo salvaje y las moscas mutantes que carecen de un gen NF-kB, Relish (Rel E20) 14, se cargaron en dos DAM2 monitores de actividad (n = 32 para cada genotipo) y se infectaron como se describió anteriormente. Las moscas se mantuvieron en luz constante para eliminar la influencia del reloj circadiano en el comportamiento y la infección 2,7,8. Los mutantes E20 Rel se isogenized a CS como se ha descrito prev...

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Discusión

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Este protocolo describe un enfoque para investigar cómo el comportamiento, particularmente dormir, está vinculado a los parámetros de la respuesta inmune. Estos parámetros incluyen la carga bacteriana, los resultados de supervivencia, y la actividad de NF-kB, medido por un indicador de luciferasa in vivo. En conjunto, estos parámetros proporcionan información sobre la capacidad de una mosca puede luchar contra una infección. La carga bacteriana y los resultados de supervivencia son parámetros de la respuesta in...

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Divulgaciones

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No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation bajo la subvención # IOS-1025627 y por los Institutos Nacionales de Salud, bajo la concesión # 1R21NS078582-01 a MORDAZA

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del Material Empresa Número de catálogo Comentarios
Equipo
Incubadoras Percival Scientific, Inc. I30BLLC8
I36VLC8 		Cualquier incubadora capaz de ejecutar luz programada / horarios de la temperatura es la adecuada.
Drosophila Activitiy Monitores Trikinetics Inc., Waltham, MA DAM2 Como se describe en otra parte 6, este sistema requiere una interfaz de computadora, software, y otros accesorios.
Pyrex de vidrio Tubos Trikinetics Inc., Waltham, MA PGT-5x65
Microplacas de centelleo y contador de luminiscencia Perkin Elmer TopCount NXT
12 detector 		Cualquier lector de microplacas capaz de detectar la luminiscencia puede usarse para este tipo de ensayo reportero. TopCount contiene múltiples detectores y una apiladora automática, sino que es capaz de ser programado para leer continuamente de placas múltiples.
FluorChem 8900 Alpha INNOTECH Imágenes de cultivos bacterianos es opcional, cualquier sistema de imagen digital con capacidad de luz visual es suficiente.
Micropipetas Puller Tritech Research, Inc. Narishige PC-10
Suministros
Vidrio borosilicato capilares World Precision Instrument Inc. 1B100F-4
3 ml Jeringa Fisher Scientific BD 305482
Las agujas de jeringa Fisher Scientific BD 305196 18 G - cortar la punta de la aguja para evitar daños a la tubería.
Tubo de silicona, id (0,030 ") de diámetro externo (0,065") Espesor de la pared (0,018 ") VWR 60985-706 Usa para conectar las agujas capilares de vidrio a una jeringa
Llave de paso de 3 vías Sociedad Americana Pharmaseal K75
Kontes Pellet Pestle Motor inalámbrico Fisher Scientific K749540-0000
Kontes Pellet Pestle Fisher Scientific K749521-1590
Bolas de cristal de 3 mm VWR 26396-630
Microplacas Microlite 1 + Thermo Scientific 7571 Select 96-y placas que son apropiados para la luminiscencia - que deben ser opacas.
TopSeal-A Microplacas :96-así PerkinElmer 6005185 Microplaca Press-On Film adhesivo de sellado
D-luciferina, sal de potasio BioTechnology Gold, Inc. Lucna
Software
Insomniac2 Disponible a petición de los autores costumbre, escrito por Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) Matlab basado en software que se ha utilizado rutinariamente para el análisis de sueño 2,6,11
Drosonex Disponible a petición de los autores costumbre, escrito por Thomas Coradetti (Software acera) Un PC MSVC6 programa utilizado para el análisis de supervivencia de los archivos de datos brutos recogidos con elTrikinetics sistema
Photoshop CS3 Adobe Útil para obtener el número de ufc / placa a partir de imágenes digitales (opcional)

Referencias

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Drosophila Immune ResponseSleep MeasurementBacterial ClearanceNF Kappa B ActivityLocomotor Activity MonitoringSurvival AssayColony Forming UnitsLucifer Reporter TechniqueConstant Light ConditionsFly Infection Protocol

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