Genoma escala supresiones de genes en<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de alto rendimiento

Xiuchun Ge; Ping Xu

doi:10.3791/4356

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Genoma escala supresiones de genes en

16.3K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/4356

⸱

23 de noviembre de 2012

Xiuchun Ge¹ , Ping Xu¹

¹The Philips Institute of Oral and Craniofacial Molecular Biology, Virginia Commonwealth University

En este artículo

Resumen

Un genoma único método eficaz mutación del gen se ha establecido utilizando Streptococcus sanguinis Como un organismo modelo. Este método se logra a través de PCR recombinante de alto rendimiento y transformaciones.

Resumen

Mutagénesis de transposones y deleción de un solo gen son dos métodos aplicados en knockout de genes en todo el genoma en ^1,2 bacterias. Aunque mutagénesis de transposones consume menos tiempo, menos costoso, y no requiere la información completa del genoma, hay dos puntos débiles en este método: (1) la posibilidad de una mutantes dispares en la biblioteca mixta mutante que contra-selecciona mutantes con competencia disminuido; y (2) la posibilidad de la inactivación parcial del gen mediante el cual los genes no totalmente perder su función después de la inserción de un transposón. De un solo gen análisis de deleción puede compensar los inconvenientes asociados con la mutagénesis de transposones. Para mejorar la eficiencia de todo el genoma deleción del gen individual, tratamos de establecer una técnica de alto rendimiento para todo el genoma deleción del gen único usando Streptococcus sanguinis como organismo modelo. Cada supresión construcción génica en S. sanguinis genoma está diseñado para comprender 1-Kb aguas arriba del gen diana, el gen aphA-3, proteína que codifica resistencia a la kanamicina, y 1-kb aguas abajo del gen diana. Tres conjuntos de cebadores F1/R1, F2/R2, y F3/R3, respectivamente, se diseñaron y sintetizaron en un formato de placa de 96 pocillos para PCR-amplificaciones de los tres componentes de cada construcción de deleción. Cebadores R1 y F3 contiene 25-bp secuencias que son complementarias a las regiones del gen aphA-3 en su extremo 5 '. A gran escala amplificación por PCR del gen aphA-3 se realiza una vez para crear todas las construcciones de deleción de un solo gen. El promotor del gen aphA-3 está inicialmente excluidos para minimizar el potencial efecto polar de casete de kanamicina. Para crear las construcciones de deleción de genes, de alto rendimiento de la amplificación por PCR y la purificación se realizan en un formato de placa de 96 pocillos. Un amplicón de PCR recombinante lineal para cada gen de supresión se hace a través de cuatro reacciones de PCR de alta fidelidad utilizando ADN polimerasa. El expon inicialfase de crecimiento preferencial de S. sanguinis cultivadas en caldo Todd Hewitt suplementado con 2,5% de suero de caballo inactivado se utiliza para aumentar la competencia para la transformación de la PCR recombinante construcciones. Bajo esta condición, hasta el 20% de S. células sanguinis se puede transformar usando ~ 50 ng de ADN. Sobre la base de este enfoque, 2048 mutantes con deleción de un solo gen se obtuvieron en última instancia de los 2.270 genes en S. sanguinis excluyendo cuatro ORFs de genes contenida enteramente dentro de otros ORFs en S. sanguinis SK36 y 218 genes esenciales potenciales. La técnica en la creación de construcciones de genes de deleción es de alto rendimiento y podría ser fácil de usar en todo el genoma deleciones de genes individuales para cualquier bacteria transformables.