Aislar las células melanocitos como primarios del corazón alfombrillas

Resumen

En este protocolo, w e identificado una nueva población de células melanocitos como (también conocido como melanocitos cardíacos) en los corazones de los ratones y los seres humanos que contribuyen a la arritmia auricular provoca en ratones.

Resumen

Identificamos una nueva población de células melanocitos como (también conocido como melanocitos cardíacos) en los corazones de los ratones y los seres humanos que contribuyen a los factores desencadenantes de arritmia auricular en ratones. Para investigar las propiedades eléctricas y biológicas de los melanocitos cardíacos se desarrolló un procedimiento para aislarlos de los corazones del ratón que deriva de los diseñados para aislar los cardiomiocitos murinos neonatales. A fin de obtener los melanocitos cardíacos saludables adecuados para más extensa de patch clamp o estudios bioquímicos, hemos desarrollado un procedimiento de refinado para aislar y chapado melanocitos cardíacos basados ​​en los diseñado originalmente para aislar los melanocitos cutáneos. El procedimiento de refinado se demuestra en esta revisión y produce un mayor número de células melanocitos como saludables que pueden sembrarse como una población pura o con cardiomiocitos.

Introducción

Recientemente hemos identificado una población de células novela en el corazón de los ratones y los seres humanos que expresan enzimas melanina-síntesis y se asemejan morfológicamente a los melanocitos cutáneos. Llamamos 'melanocitos cardíacos' estas células y encontramos que están presentes en localizaciones anatómicas de la que la arritmia auricular desencadena a menudo se originan en los seres humanos. También encontramos melanocitos cardiacos contribuyen a las arritmias auriculares en ratones con deleción de la línea germinal de Dct. Melanocitos cardíacos se distribuyen escasamente lo largo de la aurícula del ratón donde se comprenden menos del 0,1% de todas las células auriculares. Para investigar las propiedades eléctricas y biológicas de los melanocitos cardíacos hemos desarrollado un procedimiento para aislarlos del corazón de ratón utilizando marcadores específicos de melanocitos Cre-inducible. Nuestro procedimiento inicial se desarrolló a partir de los que se usan para aislar los cardiomiocitos murinos neonatales y dado muy pequeños números de células adecuados para las grabaciones de patch clamp o análisis de PCR. Sin embargo, para mejorar la curarª y la viabilidad de los melanocitos cardíacos, por más profundo análisis electrofisiológico o estudios bioquímicos, se desarrolló un procedimiento de refinado de los diseñados para aislar los melanocitos cutáneos. El procedimiento descrito y demostrado en esta revisión tiene la ventaja de producir melanocitos cardíacos saludables que pueden sembrarse como una población pura o con cardiomiocitos.

Protocolo

1. Preparar las soluciones y equipos necesarios

1. En primer lugar, esterilizar los instrumentos quirúrgicos (pinzas rectas forma, fórceps forma curvada, tijeras de formas rectas y tijeras de formas curvas) en autoclave durante 15 min. a 121 ° C. Prepare 2 juegos de instrumentos, donde se utiliza un conjunto para la disección de los corazones y el otro conjunto se utilizarán para picar el tejido.
2. Disuelva 1 paquete de MCDB153 medios de cultivo en 900 ml de esterilizado, agua filtrada y revuelva lentamente hasta que el polvo se haya disuelto. Añadir 1,2 g de bicarbonato de sodio, o 15,7 ml de solución de bicarbonato de sodio [7,5% w / v], por cada litro de volumen final de medio que se preparó y se agita hasta que se disuelva. Ajustar el pH a 7,2 mediante la adición de cualquiera de 1 N HCl o NaOH 1 N, y luego verter los medios de comunicación a través de un filtro de 0,2 micras superior botella en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos (gabinete de bioseguridad). Luego recoger los medios de comunicación y almacenarla a 4 ° C.
3. Preparar los suplementosañadir al medio de cultivo (Lista de Materiales). Los suplementos deben añadirse a los medios de comunicación justo antes de los medios de comunicación es necesaria para el recubrimiento de las células.
4. Preparar DPBS con 10% de FBS más antibióticos (penicilina y estreptomicina).
5. A continuación, preparar una solución de tripsina al 0,25% mediante la adición de 0,25 g de tripsina (páncreas bovino, actividad> 2500 unidades USP / mg, ultrapura; USB) a 100 ml de DPBS más antibióticos (penicilina y estreptomicina).
6. Otro equipo requerido necesario para completar este procedimiento incluyen un microscopio estereoscópico, placas Petri (10 cm), tubos cónicos de 50 ml, coladores de células de 40 micras, DPBS más antibióticos, placas de cultivo de 60 mm y placas de cultivo de 35 mm.

2. Aislar Corazones de Neonatología mouse Pups

1. En primer lugar, obtener P0 a P2 crías de ratón neonatal (n = 6 a 8). Se recomienda utilizar los cachorros generados por la cría de DCT-Cre hembras con los machos homocigotos que son heterocigotos para ya sea el alelo R26R: EYFP o la Z / EG alelo para etiquetar elcélulas melanocitos similares. Tanto R26R: ratones EYFP y Z / EG están disponibles de Jackson Laboratories (números de existencias 006.148 y 003.920, respectivamente).
2. A continuación, la eutanasia a las crías de ratón neonatales, limpie el pecho con un algodón con alcohol y luego colocar los cachorros en una placa de 10 cm de Petri con DPBS.
3. Cortar la piel sobre el pecho y el esternón con pinzas y tijeras esterilizadas y luego abrir el pecho cuidadosamente bajo un microscopio estereoscópico. Los corazones de crías de ratón neonatales son muy pequeñas, así que tenga cuidado para asegurarse de extirpar todo el corazón con las aurículas adjuntos.
4. Lavar los corazones en DPBS y transferirlos a una nueva placa de 10 cm Petri.

3. digestión enzimática

1. Llevar la placa de Petri con los corazones extirpados a una campana de cultivo de tejidos (gabinete de bioseguridad) y siga los pasos a continuación utilizando técnicas estériles en la campana.
2. En primer lugar, lavar el corazón tres veces en DPBS estériles más antibióticos.
3. Coloca los corazones (n = 6-8) en un60-mm placa de cultivo y añadir 6-8 ml de solución de tripsina al 0,5% al ​​plato.
4. A continuación, cortar los corazones en trozos pequeños (menos de 1 mm de tamaño) y los incuban a 37 ° C durante 30 min en una atmósfera de _CO2 al 5%.
5. Después del período de incubación es completa, se vierte la solución resultante del tejido cardíaco y la tripsina de la placa en un tubo cónico de 50 ml estéril.
6. Luego, utilizando una pipeta estéril de 10 ml, rápidamente, pero suavemente, se tritura la solución en el tubo cónico de 50 ml 30-50 veces.
7. Se filtra la solución resultante a través de un filtro de células de 40 m en la parte superior de un nuevo tubo cónico de 50 ml limpio, para recoger el filtrado.
8. A continuación, se centrifuga el tubo de 50 ml a 240 x g en una centrífuga de mesa durante 5 min a temperatura ambiente. Luego, aspirar suavemente el sobrenadante y resuspender el sedimento restante en 6-8 ml de DPBS estériles. Repita este paso 2 veces más. Este paso Bolitas de los miocitos auriculares y melanocitos cardíacos, pero no bajar la fifibroblastos desde los fibroblastos son más pequeños y permanecerán en el sobrenadante.

Las células 4. Plating cardíaca melanocitos como

1. Tras el tercer enjuague después de la centrifugación, cuidadosamente drenar o aspirar fuera de la solución de lavado (DPBS) y resuspender el precipitado en 6 ml de medios de cultivo MCDB al que se han añadido los suplementos.
2. Ahora, dibuja la solución resuspendido en una pipeta de transferencia estéril y colocar las células en una placa de 35 mm, o en un pocillo de una placa de 6 pocillos, y poner en común las células cardíacas aisladas de 3 ratones recién nacidos en una placa de 35 mm o así.
3. Incubar los platos durante la noche a 37 ° C en una atmósfera de _CO2 al 5%, aspirar fuera de los medios de cultivo junto con las células no unidas y luego enjuague las placas una vez con DPBS. A continuación, añadir medio fresco a las placas y vuelva a colocar los medios de comunicación cada 2 días. Células aisladas de corazones neonatales o embrionarias se pueden mantener en cultivo durante un máximo de 3 semanas, mientras que las células aisladas de oír adultosts se pueden mantener en cultivo durante un máximo de 10 días.

Las células 5. Isolating cardíaca melanocitos como de corazón de ratón adulto

1. En primer lugar, eliminar los corazones de ratones maduros (3-4 semanas de antigüedad, n = 3) a través de una esternotomía de línea media después de la administración de heparina 100 U intraperitoneal a los ratones y luego la eutanasia de ellos. Se recomienda el uso de pentobarbital para practicar la eutanasia a los ratones para este procedimiento, pero este fármaco no está disponible en todas las ubicaciones.
2. A continuación, lavar los corazones extirpados en DPBS estériles que contienen antibióticos en una campana de cultivo de tejidos (gabinete de bioseguridad). Apriete los corazones ligeramente con unas pinzas de disección curvas para eliminar la sangre que queda de ellos y luego enjuague los corazones en DPBS una vez más.
3. Retire las aurículas y el anillo atrioventricular de los corazones (estas estructuras contienen las células melanocitos similares) y colocar las muestras de tejidos extirpados en una placa de 35 mm.
4. Cortar los corazones en trozos pequeños con unas tijeras curvas y fuerzaps y luego añadir 6-8 ml de solución de tripsina al 0,5% al ​​plato. Incubar los platos a 37 ° C durante 45-60 min.
5. Ahora, siga los pasos del procedimiento anterior desde el paso 3.6 en adelante.

Resultados

El protocolo descrito en este artículo es una técnica mejorada en comparación con la que previamente publicados para el aislamiento de melanocitos cardíacos del corazón murino. Este procedimiento emplea el uso de marcadores fluorescentes impulsados ​​por la síntesis de melanina-enzima Cre-recombinasa específica para marcar las células melanocitos como cardíacas. Es importante usar un marcador para etiquetar melanocitos cardíacos cuando se trabaja con células embrionarias o neonatales recién aislados, puesto que las dife...

Discusión

Melanocitos cardíacos están presentes en localizaciones anatómicas dentro del corazón que normalmente dan lugar a los factores desencadenantes de arritmia auricular. Estas regiones incluyen las venas pulmonares, el anillo atrioventricular, la aurícula izquierda posterior y el foramen oval (Figura 4). Para entender el papel que estas células juegan en arritmogénesis, desarrollamos técnicas para aislar a ellos y estudiar su fisiología. Sin embargo, nos dimos cuenta de que la mejora de esta técnica para pr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
MCDB 153	Sigma-Aldrich	M7403	Disolver en agua
DPBS, sin calcio ni magnesio	Invitrogen	14190136	Conc. stock: 1x Conc. de trabajo: 1x
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen	15140163	Conc. stock: 100x Conc. de trabajo: 1x
Suero bovino fetal	Life Technology	Certificado	Conc. de trabajo: 4%
TPA	Sigma-Aldrich	P1585	Disolver en DMSO Conc. stock: 3,2 μM Conc. de trabajo: 32 nM
Transferrina	Sigma-Aldrich	T8158	Disolver en DPBS Conc. stock: 0,1 mg/ml Conc. de trabajo: 1 μg/ml
AMP cíclico dibutirilo	Sigma-Aldrich	D0627	Disolver en DPBS Conc. stock: 0,5 mM Conc. de trabajo: 5 μM
Insulina	Sigma-Aldrich	I6634	Disolver en ácido acético 10 mM Conc. stock: 1 mg/ml Conc. de trabajo: 5 μg/ml
FGF básico	BD Biosciences	354060	Disolver en agua Conc. stock: 4 ng/μl Conc. de trabajo: 4 ng/ml