Aislar las células melanocitos como primarios del corazón alfombrillas

Resumen

En este protocolo, w e identificado una nueva población de células melanocitos como (también conocido como melanocitos cardíacos) en los corazones de los ratones y los seres humanos que contribuyen a la arritmia auricular provoca en ratones.

Resumen

Identificamos una nueva población de células melanocitos como (también conocido como melanocitos cardíacos) en los corazones de los ratones y los seres humanos que contribuyen a los factores desencadenantes de arritmia auricular en ratones. Para investigar las propiedades eléctricas y biológicas de los melanocitos cardíacos se desarrolló un procedimiento para aislarlos de los corazones del ratón que deriva de los diseñados para aislar los cardiomiocitos murinos neonatales. A fin de obtener los melanocitos cardíacos saludables adecuados para más extensa de patch clamp o estudios bioquímicos, hemos desarrollado un procedimiento de refinado para aislar y chapado melanocitos cardíacos basados ​​en los diseñado originalmente para aislar los melanocitos cutáneos. El procedimiento de refinado se demuestra en esta revisión y produce un mayor número de células melanocitos como saludables que pueden sembrarse como una población pura o con cardiomiocitos.

Introducción

Recientemente hemos identificado una población de células novela en el corazón de los ratones y los seres humanos que expresan enzimas melanina-síntesis y se asemejan morfológicamente a los melanocitos cutáneos. Llamamos 'melanocitos cardíacos' estas células y encontramos que están presentes en localizaciones anatómicas de la que la arritmia auricular desencadena a menudo se originan en los seres humanos. También encontramos melanocitos cardiacos contribuyen a las arritmias auriculares en ratones con deleción de la línea germinal de Dct. Melanocitos cardíacos se distribuyen escasamente lo largo de la aurícula del ratón donde se comprenden menos del 0,1% de to....

Protocolo

1. Preparar las soluciones y equipos necesarios

1. En primer lugar, esterilizar los instrumentos quirúrgicos (pinzas rectas forma, fórceps forma curvada, tijeras de formas rectas y tijeras de formas curvas) en autoclave durante 15 min. a 121 ° C. Prepare 2 juegos de instrumentos, donde se utiliza un conjunto para la disección de los corazones y el otro conjunto se utilizarán para picar el tejido.
2. Disuelva 1 paquete de MCDB153 medios de cultivo en 900 ml de esterilizado, agua filtrada y revuelva lentamente hasta que el polvo se haya disuelto. Añadir 1,2 g de bicarbonato de sodio, o 15,7 ml de solución de bicarbonato de sodio [7,5% w / v], por cada li....

Resultados

El protocolo descrito en este artículo es una técnica mejorada en comparación con la que previamente publicados para el aislamiento de melanocitos cardíacos del corazón murino. Este procedimiento emplea el uso de marcadores fluorescentes impulsados ​​por la síntesis de melanina-enzima Cre-recombinasa específica para marcar las células melanocitos como cardíacas. Es importante usar un marcador para etiquetar melanocitos cardíacos cuando se trabaja con células embrionarias o neonatales recién aislados, puesto que las dife.......

Discusión

Melanocitos cardíacos están presentes en localizaciones anatómicas dentro del corazón que normalmente dan lugar a los factores desencadenantes de arritmia auricular. Estas regiones incluyen las venas pulmonares, el anillo atrioventricular, la aurícula izquierda posterior y el foramen oval (Figura 4). Para entender el papel que estas células juegan en arritmogénesis, desarrollamos técnicas para aislar a ellos y estudiar su fisiología. Sin embargo, nos dimos cuenta de que la mejora de esta técnica para pr.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
MCDB 153	Sigma-Aldrich	M7403	Disolver en agua
DPBS, sin calcio ni magnesio	Invitrogen	14190136	Conc. stock: 1x Conc. de trabajo: 1x
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen	15140163	Conc. stock: 100x Conc. de trabajo: 1x
Suero bovino fetal	Life Technology	Certificado	Conc. de trabajo: 4%
TPA	Sigma-Aldrich	P1585	Disolver en DMSO Conc. stock: 3,2 μM Conc. de trabajo: 32 nM
Transferrina	Sigma-Aldrich	T8158	Disolver en DPBS Conc. stock: 0,1 mg/ml Conc. de trabajo: 1 μg/ml
AMP cíclico dibutirilo	Sigma-Aldrich	D0627	Disolver en DPBS Conc. stock: 0,5 mM Conc. de trabajo: 5 μM
Insulina	Sigma-Aldrich	I6634	Disolver en ácido acético 10 mM Conc. stock: 1 mg/ml Conc. de trabajo: 5 μg/ml
FGF básico	BD Biosciences	354060	Disolver en agua Conc. stock: 4 ng/μl Conc. de trabajo: 4 ng/ml