Se introduce un nuevo método para el mantenimiento de la mucosa intestinal humana en la cultura y el seguimiento de la respuesta a diversos tipos de estímulos durante al menos 24 horas. Con nuestro método, se mantiene la polaridad del tejido, lo que permite una estimulación fisiológica a través de la ruta apical.
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Artículo de método
Un nuevo método para la Cultura y polarizado estimulación de explantes mucosa intestinal humana
En este artículo
Resumen
Resumen
Pocos modelos existen actualmente para simular de forma realista micro-entorno del complejo del intestino humano, donde una variedad de interacciones tienen lugar. La homeostasis adecuada depende directamente en estas interacciones, que dan forma a una respuesta inmunológica toda la inducción de tolerancia contra antígenos de los alimentos, mientras que al mismo tiempo de montaje de las respuestas inmunes eficaces contra los microbios patógenos ingeridos accidentalmente con alimentos.
La homeostasis intestinal se conserva también a través de diversas interacciones complejas entre la microbiota (incluyendo cepas bacterianas beneficiosas relacionados con los alimentos) y el anfitrión, que regulan la fijación / degradación de la mucosidad, la producción de péptidos antimicrobianos por la barrera epitelial, y la "enseñanza" de células epiteliales de que controla el fenotipo tolerogenic o inmunogénica de las células linfoides únicos, gut-residentes "poblaciones. Estas interacciones han sido hasta ahora muy difícil de reproducir en los ensayos in vitroya sea utilizando líneas de células cultivadas o células mononucleares de sangre periférica. Además, los modelos de ratón difieren sustancialmente en los componentes de la mucosa intestinal (organización capa de moco, las bacterias comensales comunidad) con respecto a el intestino humano. Por lo tanto, los estudios de una variedad de tratamientos de cesación en las clínicas para las condiciones importantes relacionados con el estrés o patológicos tales como el síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria del intestino o cáncer colorrectal han sido difíciles de llevar a cabo.
Para abordar estas cuestiones, hemos desarrollado un novedoso sistema que nos permite estimular explantes de mucosa intestinal humana que mantienen su in situ acondicionado por la microbiota de acogida y la respuesta inmune, de manera polarizada. Estimulación apical polarizado es de gran importancia para el resultado de la respuesta inmunitaria provocada. Se ha demostrado repetidamente que los mismos estímulos pueden producir completamente diferentes respuestas cuando se pasan por alto la cara apical de la epi intestinalthelium, estimulación de las células epiteliales hacia la membrana basolateral o que entren en contacto directo con los componentes de la lámina propia, cambiando el fenotipo de tolerógeno a inmunogénica y causando la inflamación innecesaria y excesiva en la zona.
Hemos logrado la estimulación polarizada por un cilindro de encolado cueva que delimita la zona de estimulación en la cara apical de la mucosa como se describe en el protocolo. Se utilizó este modelo para examinar, entre otros, los efectos diferenciales de las tres cepas de lactobacilos diferentes. Se demuestra que este modelo de sistema es muy poderoso para evaluar las propiedades inmunomoduladoras de los probióticos en buenas condiciones de salud y la enfermedad.
Protocolo
1. Obtención y preparación del tejido
- Se obtiene de tejido (sano o EII mucosa) durante la cirugía. Una vez que la muestra se extirpa transferencia al laboratorio tan pronto como sea posible, manteniéndolo en Ca + + / Mg + + tampón HBSS suplementado con penicilina / estreptomicina a 4 º C o en hielo.
* El tamaño de la muestra depende de la disponibilidad del tejido: la parte del tejido obtenido, es estrictamente lo que no se necesita para el diagnóstico y puede variar en gran medida entre sujetos sanos y EII. El tejido sano se escindió de los pacientes sometidos a cirugía por cáncer de colon.
- Lave el tejido suave y limpiarlo de todo el material mesentérica. Se separa la capa mucosa de la submucosa usando tijeras y pinzas estériles mientras se mantiene el tejido en tampón HBSS en una placa de Petri (no necesariamente sumergido). Toque la superficie de la mucosa con la pinza lo menos posible.
- Cortar mucosa en las rayas, al menos, 1 cm de ancho y el mayor tiempo posible. Utilice dos bisturís estériles, tanto como si estuviera cortando los alimentos.
- Lavar limpiar suavemente la mucosa en HBSS y se extienden sobre una placa de Petri con la parte apical hacia arriba.
2. Montaje del tejido
- Preparar medio fresco (tisDMEM). Utilizar DMEM suplementado con glutamina (2 mM) y NaPyr (1 mM), y añadir 15% de FBS-Na (suero bovino fetal - América del Norte), 1% SU-X y 200 ng / ml de EGF en el momento de uso.
- Llenar una placa Petri de 10 cm con el resto de la FBS-Na (utilizar alrededor de 30 ml de manera que las rejillas de metal serán completamente sumergidos) y sumerja las rejillas de metal. Mantenga la placa de abrir y apoyar los cilindros de plástico de su grifo.
* Las rejillas metálicas están hechas de hierro. La malla es de forma cuadrada con un lado de 0,5 mm.
- Tome 3 l de pegamento quirúrgico con un 10 o 20 l pipeta. Aplicar con cuidado a una de las fronteras de un cilindro de plástico mientras mantiene It fIRM con las pinzas.
- Colocar suavemente el cilindro en el lado apical de la mucosa, lo más cercano a uno de los bordes de la tira como sea posible.
- Para dar el tiempo de pegamento para unir firmemente el cilindro sobre el tejido, preparar la placa de cultivo de órganos de centro-así: Dispensar 850 l-1 ml de medio en el centro y así apoyar la rejilla de metal en los bordes del pocillo central de la placa.
- Cortar el exceso de tejido de los bordes del cilindro con dos escalpelos estériles como antes.
- Levante con cuidado el cilindro con el tejido adjunto y coloque el lado basolateral de la rejilla metálica en el centro de la placa.
3. Estímulo
- Utilice los estímulos de su elección en su concentración preferida.
- Aplicar volumen apropiado en el centro del cilindro de plástico sin perturbar el cilindro o la superficie de la mucosa con la punta de la pipeta. Asegúrese de que el volumen elegido cubre uniformemente la superficie interior del cilindro. Envolúmenes dicated:
Large cilindro de plástico: 200 l
Medio cilindro de plástico: 100 l
Pequeño cilindro de plástico: 50 l - Incubar durante un máximo de 3 horas en una incubadora convencional.
* Si desea incubar puntos temporales más largos, asegúrese de usar un volumen mucho menor de los estímulos (10-20 l) y colocar directamente el tejido en una atmósfera de 100% de O 2 en la presión de 1 atm (ver 3.5) .
- Tome el medio con los estímulos de la superficie apical de los tejidos y no sustituyen con un nuevo medio, debido a que el tejido no recibe suficiente O 2 si una gruesa capa de soporte en la cara apical impide el intercambio gaseoso. Cubra el plato.
- Coloque el tejido en una atmósfera de 100% de O 2 en la presión de 1 atm.
4. Cosecha
- Después de 24 horas de tiempo total de cultivo (± 2,5 h) retirar con cuidado el cilindro de thtejido de correo con la ayuda de un escalpelo pegamento raspando suavemente y almacenarlo en función del análisis deseado (fijar para inmunohistoquímica y / o ensayos de inmunofluorescencia, o congelamiento rápido en N2 líquido para la purificación de ARN y perfiles de expresión génica o la purificación de proteínas y ensayos de Western blot ).
- Se recoge el medio basolateral para el perfil de secreción de citoquinas. Centrifugar a 8000 rpm durante 7 min a los desechos de pellets, transferir el sobrenadante en un tubo Eppendorf (alternativamente alícuota) y almacenar inmediatamente a -20 ° C.
* Si desea mantener sobrenadantes durante más tiempo, guárdelas a -80 ° C.
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Resultados
Hemos tenido éxito en el mantenimiento de la mucosa intestinal humana sana y EII en cultivo durante al menos 24 horas preservar el bienestar de los tejidos. De acuerdo con observaciones anteriores 1, esto sólo era posible si la mayoría del tiempo de cultivo (al menos el 85% del total) se llevó a cabo en O 2, como el tejido no sobrevivió durante 24 horas en incubadoras convencionales (Figura 2). También hemos demostrado que las diferentes respuestas de los explantes pueden ser obser...
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Discusión
Mucho tiempo se ha hecho hincapié en la necesidad de modelos fisiológicamente relevantes en los que los tratamientos para la mucosa intestinal humana se pueden probar válida. Muchos investigadores han identificado artefactos y defectos tanto en la célula 5 y 6 modelos de ratón utilizado hasta ahora para tal fin. En efecto, a pesar de que los datos preclínicos prometedores se obtienen a menudo, éstos rara vez se traducen en un beneficio clínico significativo.
El método d...
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Damos las gracias a Erika Mileti para un excelente soporte técnico y el Dr. Antonio Di Sabatino para proporcionar las cámaras de oxígeno.
Financiación: Este trabajo fue apoyado por becas de los programas marco de la UE séptimo (IBDase, ERC: Dendroworld) y Fondazione Cariplo a MR y el apoyo de una red Marie Curie de Formación Internacional Movilidad (Cross-Talk, del acuerdo de subvención n º: 21553-2) para KT.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos | |||
| HBSS 10X | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamicina | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| ITS-X 100X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamina | Lonza | BE17605E | |
| Aminoácidos no esenciales 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materiales | |||
| Cilindros de clonación 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cilindros de clonación 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cilindros de clonación 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Rejillas metálicas | Hecho en casa | ||
| Placa de cultivo organotípico con pocillo central | BD Falcon | 353037 | |
| Adhesivo quirúrgico (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Botes de oxígeno | Hecho en casa | ||
| Tanques de oxígeno | Air Liquid Sanità |
Referencias
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056(2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
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- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
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- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356(2011).
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Reimpresiones y permisos
