Summary
Hemos desarrollado un ensayo de fusión celular que cuantifica SNARE mediada por los acontecimientos de fusión de membrana por la expresión activa de β-galactosidasa.
Abstract
Las interacciones de las SNARE (s oluble N-etilmaleimida factor sensible a una proteína ttachment ceptor re) proteínas en vesículas (v-SNARE) y en membranas diana (t-SNARE) catalizan la fusión de vesículas intracelulares 1-4. Ensayos de reconstitución son esenciales para disecar el mecanismo y la regulación de la fusión de membranas mediada por 5-SNARE. En un ensayo de fusión celular 6,7, las proteínas SNARE se expresan ectópicamente en la superficie celular. Estos "volteado" SNARE unidad proteínas de fusión célula-célula, lo que demuestra que trampas son suficientes para fusionar las membranas celulares. Debido a que el ensayo de fusión celular se basa en el análisis microscópico, que es menos eficiente cuando se usa para analizar múltiples interacciones y v-t-SNARE cuantitativamente.
Aquí se describe un nuevo ensayo que cuantifica 8 SNARE mediada por los acontecimientos de fusión celular activado por la expresión de β-galactosidasa. Doscomponentes del sistema de genes Tet-Off expresión 9 se utiliza como un sistema de lectura: el transactivador controlado por tetraciclina (tTA) y un plásmido informador que codifica el gen LacZ bajo el control del elemento de respuesta de tetraciclina (TRE-LacZ). Nos transfectar tTA en células COS-7 que expresan volteado v-SNARE proteínas en la superficie celular (V-células) y transfección de TRE-LacZ en células COS-7 que expresan volteado t-SNARE proteínas en la superficie celular (células T) . SNARE dependiente de la fusión de la V-y las células T resulta en la unión de tTA a TRE, la activación transcripcional de LacZ y la expresión de β-galactosidasa. La actividad de β-galactosidasa se cuantificó usando un método colorimétrico por absorbancia a 420 nm.
Las proteínas asociadas a la membrana de vesículas (vampiros) son v-SNARE que residen en diferentes compartimentos de Golgi post-vesiculares 10-15. Mediante la expresión de VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 y 8 en el mismo nivel, se compara su fusión de membranasactividades utilizando el ensayo de células de fusión enzimática. Sobre la base de la medición espectrométrica, este ensayo ofrece un enfoque cuantitativo para el análisis de SNARE mediada por fusión de membranas y para estudios de alto rendimiento.
Protocol
1. Cultivo de células y transfección
- Células COS-7 se cultivaron en medio Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) suplementado con 4,5 g / l de glucosa y 10% de suero fetal bovino (FBS).
- Transfección del plásmido se lleva a cabo con Lipofectamine según las instrucciones del fabricante (Invitrogen).
2. Análisis de fluorescencia microscópica de la superficie celular Expresión SNARE
- El día antes de la transfección, 3 × 10 4 células COS-7 se sembraron en cubreobjetos de vidrio estériles de 12 mm (Fisher Scientific) que figuran en placas de 24 pocillos.
- Para V-células en cada pocillo, 0,25 g del plásmido que codifica tTA (pTet-Off, Clontech) se cotransfectaron con 0,25 g de los plásmidos que expresan volteado VAMPS.
- Para las células T en cada pocillo, 0,25 g de plásmido que codifica la TRE-LacZ (pBI-G, Clontech) se cotransfectaron con 0,25 g de cada uno de los plásmidos que expresan volteado SNAP-25 y syntaxins 1 o 4.
- 24 horas después de transfection, las células se fijan con 4% de paraformaldehído en PBS + + (PBS suplementado con 0,1 g / l CaCl 2 y 0,1 g / l MgCl 2) durante 10 min, y después se bloquearon en FBS al 10% en PBS + + de 30 min.
- Las células se incubaron durante 1,5 h con las 9E10 anticuerpos monoclonales anti-Myc (sobrenadante del cultivo de hibridoma puro).
- Después de cuatro lavados con PBS + +, las células se incubaron durante 1 h con FITC conjugado con anticuerpos secundarios (Jackson ImmunoResearch Laboratories) a una dilución de 1:500.
- Después de cuatro lavados con PBS + +, las células marcadas se montan en Prolong antifade reactivo Gold (Invitrogen).
- Imágenes confocales se recogen en un láser confocal de barrido microscopio Olympus. Las imágenes se procesaron con el software Adobe Photoshop.
3. FACS Análisis de la expresión SNARE superficie celular
- El día antes de la transfección, 2 × 10 5 células COS-7 se sembraron en cada pocillo de placas de 6 pocillos.
- 24 horas después del transfection con el volteado SNARE, pTet-Off y plásmidos pBI-G, las células se fijaron con paraformaldehído al 1% en PBS + + durante 15 min, y después se bloquearon en FBS al 10% en PBS + + de 15 min.
- Las células se incubaron con los anticuerpos 9E10 monoclonales anti-Myc por 60 min.
- Después de tres lavados con PBS + +, las células se marcan con FITC conjugado con anticuerpos secundarios (1:200 dilución) durante 45 min.
- Después de tres lavados con PBS + +, las células se raspan de las placas con un raspador de células.
- 15.000 células se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences). La intensidad media de fluorescencia de cada muestra se obtuvieron usando el software CellQuest Pro.
4. Ensayo de fusión célula enzimática
- El día antes de la transfección, 1,2 x 10 6 células COS-7 se siembran en cada placa de cultivo tisular 100-mm cultura, y 2 × 10 5 células COS-7 se sembraron en cada pocillo de placas de 6 pocillos.
- Por v-células, 0,5 - 5 mg cada una de flipped plásmido VAMP se cotransfectaron con 5 g de pTet-Off en las células en cada placa de cultivo de 100-mm. Control de las células se cotransfectaron con el vector pcDNA3.1 vacío (+) y pTet-Off. Para evitar que la N-glicosilación de VAMPS 1, 4, 5, 7 y 8, tunicamicina (10 mg / ml) se incluye en medio de cultivo celular durante la transfección.
- Para las células T en cada pocillo de las placas 6-y, 1 g de volteado SNAP-25 plásmido pBI-G y se cotransfectan con 0,5 ug de plásmido syntaxin1 volteado o 0,05 g de volteado syntaxin4 plásmido.
- 24 horas después de la transfección, las células en V se desprenden de las placas de cultivo con la enzima libre de disociación celular Buffer (Invitrogen). Independiente células se cuentan con un hemocitómetro y se resuspendieron en HEPES tamponada con DMEM suplementado con FBS al 10%, 6,7 mg / ml tunicamicina y 0,67 mM de DTT.
- 4,8 × 10 5 v-resuspendieron las células se añaden a cada pocillo que ya contenía las células-T.
- Después de 6, 12 o 24 hr rata 37 ° C en 5% de CO 2
- Después de 90 min, la reacción colorimétrica se detiene mediante la adición de carbonato de sodio 1 M.
- La absorbancia a 420 nm se midió utilizando un espectrofotómetro HITACHI 100-40.
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Representative Results
Para desarrollar un ensayo de fusión celular cuantitativos, se aprovecha de la fuerte activación transcripcional por la unión de tTA a TRE. En ausencia de tTA, la transcripción del gen LacZ en TRE-LacZ está en silencio. Cuando tTA está presente, se une a la TRE y activa la transcripción de lacZ. Figura 1 muestra un diagrama de flujo de la fusión de células de ensayo enzimático. tTA se transfecta en v-células que expresan v-SNARE proteínas en la superficie celular, y TRE-LacZ se transfecta en células T que expresan t-SNARE proteínas en la superficie celular. Fusión de la V-y las células T resulta en la unión de tTA a TRE, la activación de la transcripción de lacZ, y la expresión de β-galactosidasa.
La Figura 2A ilustra la estructura de dominio de las construcciones de SNARE volteado. La secuencia señal preprolactin se fusiona al N-terminales de las trampas. Estas trampas de ingeniería se llaman "volteado"SNAREs porque la orientación de sus motivos SNARE en contra de las membranas celulares se da la vuelta. Cuando células COS-7 se transfectaron con plásmidos volteado SNARE, volteado proteínas SNARE se expresan en la superficie celular (Figura 2B). La citometría de flujo se utiliza para medir los niveles de expresión de las proteínas SNARE en la superficie celular (Figuras 2C y D). Con el fin de comparar sus capacidades de fusión de membrana, VAMPS necesitan ser expresados en el mismo nivel. Por lo tanto, se valoraron y se optimizó la concentración de cada volteado SNARE plásmido utilizado en la transfección. Flipped SNARE plásmidos se transfectaron en las siguientes concentraciones (por cada 10 cm 2 área de crecimiento, es decir, por pocillo en placas de 6 pocillos): VAMP1, 0,2 g; VAMP3, 0,5 g; VAMP4, 0,5 g; VAMP5, 0,05 g; VAMP7, 1,0 g; VAMP8, 0,1 g; syntaxin1, 0,5 g; syntaxin4, 0,05 g. TTA, TRE-LacZ y se volcó SNAP-25 se cotransfectaron a 1 g por 10 cm zona de crecimiento 2. Bajo éxitoh Condiciones, VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 y 8 se expresan en el mismo nivel, mientras que syntaxins 1 y 4 se expresan en el mismo nivel en la superficie celular (Figura 2D). Como se muestra por análisis de contraste de la imagen confocal y fase (2E Figura), 80% de las células COS-7 se transfectaron con plásmidos volteado SNARE. Análisis de imágenes de doble etiquetado (Figura 2F) indica que el 70% de las células transfectadas v-expresar tanto tTA y volteado proteínas VAMP. Debido a que el gen LacZ en TRE-LacZ no se expresa antes de la fusión celular, que no son capaces de determinar el porcentaje de transfectado las células T que expresan tanto TRE-LacZ y se volcó t-SNARE proteínas.
Las trampas neuronales (v-SNARE VAMP2 y syntaxin1 t-SNARE y SNAP-25) que median la exocitosis sináptica se utilizan para probar la viabilidad de la prueba. En efecto, cuando las células que expresan v-VAMP2 y las células T que expresan syntaxin1/SNAP-25 se combinan, robusto β-Galactosidase expresión se detecta (Figura 3). Sin embargo, cuando sea VAMP2 o SNAP 25-no se expresa, sólo basal β-galactosidasa se detecta actividad, lo que indica que la fusión celular y la expresión de β-galactosidasa se basan en interacciones de v-y t-SNARE. Estos resultados indican que el ensayo de fusión celular enzimática identifica emparejamientos fusogénicos entre V y t-SNARE eficiente.
Mediante la expresión de las proteínas VAMP en el mismo nivel en la superficie celular (Figura 2D), se comparan sus actividades de fusión de membranas. Con el t-SNARE syntaxin1/SNAP-25, VAMPS 1, 3, y 8 tienen comparable y las actividades más altas de fusión, mientras que VAMPS 4 y 7 tienen 50% y 30% más bajas actividades de fusión, respectivamente (Figura 4). En contraste, cuando VAMP5 se combina con el t-SNARE, sólo basal β-galactosidasa se detecta actividad (Figura 4), lo que sugiere que VAMP5 no conduce fusión de la membrana con el Syntaxin1/SNAP-25.
Figura 1. Ensayo enzimático de la fusión celular. tTA se cotransfectaron con volteado v-SNARE plásmidos, y TRE-LacZ se cotransfectó con volteado t-SNARE plásmidos. La fusión de tipo V y las células T conduce a la unión de tTA a TRE y la expresión de β-galactosidasa, que se mide mediante un método colorimétrico.
Figura 2. Expresión de volteado SNAREs en la superficie celular. (A) la estructura de dominio de volteado trampas. La secuencia señal preprolactin (SS) se fusiona a los extremos N de las trampas, y una etiqueta Myc se inserta entre la secuencia señal y los motivos SNARE (espiral de la bobina). (B) células COS-7 se cotransfectan con tTA y el vector vacío pcDNA3.1 (+) o volteado VAMP5 plásmido. 24h después de la transfección, las células unpermeabilized se tiñeron con un anticuerpo monoclonal anti-Myc. Representante de un único segmento confocal de imágenes se muestran. (C y D) 24 hr después de la cotransfección con tTA y pcDNA3.1 (+) o volteado Vamps (V-células), o 24 horas después de la cotransfección con TRE-LacZ, volteado SNAP-25 y syntaxins 1 o 4 (T-células ), las células unpermeabilized se tiñeron con el anticuerpo anti-Myc y se analizaron por citometría de flujo. (C) representativos perfiles FACS de las células transfectadas con pcDNA3.1 (+) o volteado VAMP1 plásmido. La intensidad media de fluorescencia de cada muestra se determina usando el software CellQuest Pro. (D) Para expresar VAMPS en el mismo nivel y expresa syntaxins 1 y 4 en el mismo nivel en la superficie celular, volteado SNARE plásmidos se transfectaron en concentraciones valoradas. Se muestran las intensidades medias de fluorescencia de la tinción de la superficie celular de las proteínas SNARE. Las barras de error representan la desviación estándar de 4 experimentos independientes. (E y F) 24 hr después de cotransfe cción con tTA y volteado VAMP5 plásmido, las células se permeablized con 0,2% Triton X-100 en PBS + + y (E) se tiñeron con el anticuerpo anti-Myc, o (F) manchado dual con el anticuerpo monoclonal anti-Myc y un anticuerpo policlonal el represor TET (para detectar tTA). (E) que se muestran son representativas confocal y las imágenes de contraste de fase. El número de células transfectadas que están marcados por el anticuerpo anti-Myc (VAMP5) y el número total de células en el canal de contraste de fase se cuentan (n = 60 células), y la eficiencia de la transfección se calcula (80%). (F) El número de células transfectadas que expresan tanto VAMP5 y tTA, y el número total de células transfectadas que expresan VAMP5, tTA o ambos se cuentan (n = 75 células transfectadas). El porcentaje de las células transfectadas que expresan tanto VAMP5 tTA y se calcula a continuación (70%). Las barras de escala, a 20 m. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 3. Fusión celular depende de las interacciones de v-y t-SNARE. v-células que expresan tTA y VAMP2 se incuban con las células T que expresan TRE-LacZ, syntaxin1 y SNAP 25-. Después de 24 h, las células se lisaron y la actividad de β-galactosidasa en los lisados de células se determinó utilizando un método colorimétrico por absorbancia a 420 nm. Línea de base sólo b-galactosidasa se detecta actividad cuando sea volteado VAMP2 o SNAP-25 plásmido se omite de la transfección.
Figura 4. Comparación de las actividades de fusión de vampiros. Bajo las condiciones de transfección optimizadas, VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 y 8 se expresan en el mismo nivel en la superficie celular de las células v. 24 horas después de la combinación de los v-células con las células T que exsyntaxin1/SNAP-25 prensa, la fusión celular se cuantificó usando el ensayo de fusión celular enzimática. Las barras de error representan la desviación estándar de 4 experimentos independientes. ** P <0,01; *** P <0,001 vs VAMP1.
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Discussion
El ensayo de células fusión original 6 determina mediadas SNARE-eventos de fusión de células mediante microscopía de fluorescencia. Aquí se describe un ensayo que cuantifica innovador SNARE mediada por los acontecimientos de fusión celular activado por la expresión de β-galactosidasa y la medición espectrométrica. Usando este ensayo, se analizan rutinariamente 15 a 20 y v-t-SNARE combinaciones en un solo experimento. Usando citometría de flujo para medir la expresión SNARE en la superficie celular, que valorar los niveles de expresión de VAMPS y comparar sus capacidades de fusión de membranas (Figuras 2 y 4). Además, usando el ensayo de fusión celular enzimática, se determinó la dependencia de la actividad de fusión de células de la densidad de la superficie celular de VAMP1 proteína, y no observaron ninguna cooperatividad de VAMP1 proteína en la reacción de fusión de 8 células, lo que sugiere que la acción concertada de complejos SNARE múltiples no se requiere para fusionar las membranas celulares.
Hay putativo N-glicosilación Motifs (Asn-X-Ser/Thr) en las proteínas SNARE. Debido a la N-glicosilación inhibe las actividades de fusión de volteado proteínas SNARE 6, dos enfoques se han utilizado para prevenir la glicosilación de las proteínas SNARE volteado. En primer lugar, el sitio de glicosilación de las mutaciones se introducen en volteado SNARE construye 6. En segundo lugar, como se describe en el protocolo actual, la tunicamicina inhibidor de N-glicosilación (6,7 g / ml) se incluyó en la reacción de la fusión celular. Además, 0,67 mM DTT, se añade en la reacción de fusión celular para evitar la formación de enlaces disulfuro entre volteado proteínas SNARE, que pueda inhibir las actividades de SNARE de fusión. Nuestros experimentos muestran que la adición de 6,7 g / ml tunicamicina y 0,67 mM de DTT en medio de cultivo celular no interfiere con la proliferación y supervivencia de células COS-7. En forma rutinaria terminar la reacción de fusión celular a las 24 h después de la combinación y v-t-células. Sin embargo, significativa SNARE mediada por la fusión de células se detecta 6 hr después de combinar v-aND T-células 8. Debido a que la reacción de fusión celular enzimática depende de la expresión de β-galactosidasa después de la fusión celular, el curso temporal de este sistema de lectura se retrasa respecto al transcurso del tiempo de la fusión de membranas mediada por volteado proteínas SNARE.
El ensayo de fusión celular enzimática ofrece un ensayo de reconstitución cuantitativa del examen de las actividades de fusión de membranas de potencial V-y t-SNARE interacciones en células de mamífero. Por coexpresan proteínas reguladoras (por ejemplo, Munc18) y SNAREs en la superficie celular o mediante la inclusión de proteínas recombinantes de regulación en la reacción de fusión celular, este ensayo puede ser utilizada para aclarar los mecanismos de regulación de la fusión de membranas mediada por SNARE. Además, este ensayo se deben tener aplicaciones en la selección de alto rendimiento para inhibidores o activadores de la fusión de membranas mediada por SNARE.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por fondos de puesta en marcha de la Universidad de Louisville y CA135123 de los Institutos Nacionales de Salud (para CH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG | |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A | |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 | |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 | |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 | |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 | |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | ||
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 | |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
References
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