Alta eficiencia, específica del sitio La transfección de células adherentes con siRNA uso de arrays de microelectrodos (MEA)

Resumen

El artículo detalla el protocolo específico de sitio de la transfección de revueltos secuencia de siRNA en un cultivo de células adherentes de mamíferos usando una matriz de microelectrodos (MEA).

Resumen

El descubrimiento de la vía de RNAi en eucariotas y el posterior desarrollo de los agentes de ARNi, como siRNA y shRNA, han logrado un método potente para el silenciamiento de genes específicos de ^1-8 para la genómica funcional y la terapéutica. Un reto importante involucrado en estudios basados ​​en RNAi es el suministro de agentes de ARNi a células diana. Tradicionales técnicas no víricas de envío, tales como electroporación grandes cantidades y métodos químicos de transfección a menudo carecen del control necesario espacial sobre la entrega y proporcionar eficiencias de transfección ^9-12 pobres. Los recientes avances en los métodos de transfección químicas tales como lípidos catiónicos, polímeros catiónicos y nanopartículas han dado lugar a eficiencias de transfección muy mejoradas ^13. Sin embargo, estas técnicas aún no ofrecen un control preciso espacial sobre la entrega que se pueden beneficiar inmensamente miniaturizado tecnologías de alto rendimiento, estudios de células individuales y la investigación de las interacciones célula-célula. nt "> avances tecnológicos recientes en la administración génica han permitido alto rendimiento de transfección de células adherentes ^14-23, una mayoría de los cuales utilizan electroporación microescala. electroporación Microscale ofrece espacio-temporal preciso control sobre la entrega (hasta células individuales) y se ha demostrado para lograr altas eficiencias de ^{19, 24-26.} Además, los enfoques basados ​​en la electroporación no requieren un prolongado período de incubación (típicamente de 4 horas) con complejos de DNA y siRNA como sea necesario en los métodos químicos de transfección basados ​​en y conducir a la introducción directa de ADN desnudo y siRNA moléculas en el citoplasma de la célula. Como consecuencia la expresión génica se puede lograr tan pronto como seis horas después de la transfección ^27. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente la utilización de matrices de microelectrodos (MEA) para sitio específico de transfección en cultivos celulares de mamíferos adherentes ^17-19. En el enfoque basado en MEA, entrega de carga genética se logra a través de micro-escala localizada electroporatien las células. Una aplicación de pulsos eléctricos a los electrodos seleccionados genera el campo eléctrico local que conduce a la electroporación de células presentes en la región de los electrodos estimulados. El control independiente de los microelectrodos proporciona un control espacial y temporal sobre la transfección y también permite múltiples experimentos de transfección basados ​​en que se realizará en el mismo cultivo aumentando la producción experimental y la reducción de la cultura a la cultura variabilidad.

Aquí se describe la configuración experimental y el protocolo para la transfección selectiva de adherentes células HeLa con un siRNA secuencia de marcado con fluorescencia codificado utilizando electroporación. El mismo protocolo también puede ser utilizado para la transfección de vectores de plásmido. Además, el protocolo aquí descrito puede extenderse fácilmente a una variedad de líneas celulares de mamíferos, con modificaciones menores. Disponibilidad comercial de los acuerdos ambientales multilaterales con modelos de electrodos tanto predefinidos y personalizados que este t técnica accesibleo La mayoría de los laboratorios de investigación con equipo básico de cultivo celular.

Protocolo

1. MEA Preparación

1. MEA para su uso en experimentos de electroporación puede ser fabricado utilizando la técnica de fotolitografía estándar como se describe anteriormente ¹⁸ o comprados directamente a los vendedores de los fabricantes de MEA, tales como sistemas de canales múltiples (http:/www.multichannelsystems.com/) y alfa MED Scientific Inc., ( http://www.MED64.com) . Los AMUMA utilizados en nuestros experimentos se fabrican en el local en la sala limpia en Arizona State University, el cual es administrado por el Centro de Inve....

Discusión

En este artículo de vídeo que demuestran el uso de MEA para sitio específico de la transfección de células HeLa con revueltos secuencia de siRNA. Una de las ventajas de esta tecnología es su aplicabilidad a diferentes líneas celulares, incluyendo líneas celulares primarias. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente la utilización de esta tecnología específica de sitio primario de la transfección de cultivo neuronal de hipocampo de rata E18 días de edad y células NIH-3T3 con revueltos secuencias de siRNA y GFP plásmi.......

Materiales

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Medios de comunicación celulares: Advanced MEM L-glutamina 200 mM Penicilina / Estreptomicina El suero fetal bovino	Gibco / Invitrogen Himedia Laboratorios / VWR Lonza Group Ltd. Gibco / Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	Celular medios composición: 2% de FBS, Pennstrep 2% de L-glutamina y 2% en Advance MEM
Tripsina EDTA	Mediatech, Inc.	25-053-CL
PBS	Mediatech, Inc.	21-040 CV-
Alexa 488 y rodamina etiquetados revueltos SEQUcia siRNA	Qiagen, Inc.	1027292
La electroporación búfer	Biorad Laboratories	165-2677
Generador de forma de onda	Pragmático	2414a	Cualquier forma de onda / generador de impulsos que puede entregar los pulsos deseado puede ser utilizado.