$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Inactivación funcional de la expresión génica en células de mamífero es crucial para el estudio de la contribución de una proteína de interés a 1,2 diversas vías. Sin embargo, desmontables condicional de la expresión génica se requiere en los casos cuando desmontables constitutiva no es tolerado por las células durante un largo periodo de tiempo 3-5. Aquí se describe un protocolo para la preparación de líneas celulares que permiten desmontables condicional de subunidades del factor de remodelación de la cromatina ACF. Estas líneas celulares de facilitar la determinación de la contribución de la ACF para la inducción de muerte celular por el adenovirus E4orf4 proteína 6. Las secuencias que codifican los ARN de horquilla corta para las subunidades Acf1 y SNF2h del factor de remodelación de la cromatina ACF se clonaron al lado de un promotor inducible por doxiciclina en un plásmido también contiene un gen para el gen de resistencia a neomicina. Resistentes a la neomicina se seleccionaron clones de células en presencia de G418 y aislado. Las líneas celulares resultantes fueron inducidos porel tratamiento con doxiciclina, y una vez Acf1 o los niveles de expresión reducida SNF2h fueron, las células fueron transfectadas con un plásmido que codifica E4orf4 o un vector vacío. Para confirmar el efecto específico de las construcciones shRNA, los niveles de Acf1 o SNF2h proteínas se restauraron a niveles de tipo silvestre por cotransfección con un plásmido que expresa Acf1 o SNF2h que se volvieron resistentes a la shRNA por introducción de mutaciones silenciosas. La capacidad de E4orf4 para inducir la muerte celular en las diferentes muestras se determinó por un ensayo de DAPI, en los que se midió la frecuencia de aparición de núcleos con morfologías apoptóticas en la población de células transfectadas 7-9.
El protocolo aquí descrito puede ser utilizado para la determinación de la contribución funcional de proteínas diferentes a la inducción de muerte celular por los socios de sus proteínas en los casos en que puede ser desmontables constitutiva celular letal.