Una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativa en<em&gt; C. elegans</em

Chao He; Jin I. Lee; Noelle L'Etoile; Damien O'Halloran

doi:10.3791/4443

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Artículo de método

Una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativa en

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DOI:

10.3791/4443

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22 de diciembre de 2012

Chao He¹ , Jin I. Lee² , Noelle L'Etoile³ , Damien O'Halloran¹

¹Department of Biological Sciences and Institute for Neuroscience, George Washington University, ²Fred Hutchinson Cancer Research Center, ³Department of Cell and Tissue Biology, University of California San Francisco

En este artículo

Resumen

Aquí describimos una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativo en Caenorhabditis elegans. La proteína quinasa G, EGL-4, es necesario para las respuestas de adaptación estables en el par de neurona sensorial primaria llamada AWC. Durante la exposición prolongados olor EGL-4 transloca del citosol al núcleo de la AWC.

Resumen

Durante la estimulación sostenida neuronas sensoriales más adaptarán su respuesta al disminuir su sensibilidad a la señal. La respuesta de adaptación ayuda a la atención de forma y también protege las células de la sobre-estimulación. La adaptación en el circuito olfatorio de C. elegans fue descrita por primera vez por Colbert y Bargmann ^1,2. Aquí, los autores definieron los parámetros del paradigma de la adaptación olfativa, que se utiliza para diseñar una pantalla genética para aislar mutantes defectuosos en su capacidad para adaptarse a los olores volátiles detectados por las células amphid Ala tipo C (AWC) neuronas sensoriales. Cuando wildtype C. elegans animales se exponen a un atractivo AWC-detectados olor ³ de 30 min se adaptarán su capacidad de respuesta al olor y entonces ignorar el olor en la adaptación de un ensayo de quimiotaxis de comportamiento para ~ 1 hr. Cuando wildtype C. elegans animales se exponen a un atractivo AWC-detectados olor de ~ 1 hr luego de ignorar el olor en la adaptación de achemotaxis comportamiento ensayo para ~ 3 h. Estas dos fases de adaptación olfativa en C. elegans fueron descritos como de corto plazo adaptación olfativa (inducido después de 30 min de exposición olor), y adaptación a largo plazo olfativo (inducido después de 60 min de exposición olor). Un trabajo posterior de L'Etoile et al., ⁴ descubierto una proteína kinasa G (PKG) llamado EGL-4 que se requiere tanto para la adaptación olfativa a corto plazo ya largo plazo en las neuronas de AWC. El EGL-4 proteína contiene una secuencia de localización nuclear que es necesaria para la respuesta a largo plazo de adaptación olfativas pero prescindible para respuestas a corto plazo de adaptación olfativas en el AWC ^4. Mediante el etiquetado de EGL-4 con una proteína fluorescente verde, que era posible visualizar la localización de EGL-4 en la AWC durante la exposición prolongada olor. El uso de este completamente funcional GFP-etiquetados EGL-4 (GFP :: EGL-4) molécula hemos sido capaces de desarrollar una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativo en la AWC ^5. El uso de este molecular lectura de la adaptación olfativa hemos sido capaces de realizar ambas pantallas genéticas de avance y retroceso para identificar animales mutantes que exhiben defectuosos patrones de localización subcelular de GFP :: EGL-4 en la AWC ^6,7. Aquí se describe: 1) la construcción de GFP :: EGL-4 animales que expresan; 2) el protocolo para el cultivo de los animales para los ensayos a largo plazo inducida por la translocación olor nucleares, y 3) la puntuación de la largo plazo olor inducida evento translocación nuclear y la recuperación (re-sensibilización) de la GFP nuclear :: EGL-4 Estado.

Protocolo

1. Construcción de GFP Tagged EGL-4 animales que expresan

Clonar la traslación de fusión GFP :: EGL-4 bajo el promotor para el gen ODR-3 (2678 pb uso directamente aguas arriba del codón de inicio): (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4. La expresión ODR-3 unidades promotoras en los pares de neuronas amphid: AWA, AWB, AWC, y débilmente en ASH.
Inyectar el plásmido (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4 de tipo salvaje (en N2) los animales en 50 ng / ml con los marcadores co-inyección estándar utilizando la línea ^germinal-8 técnicas de transformación: (p) ofm-1: : GFP ⁹ (25 ng / l), y (p) ODR 1-:: dsRed ¹⁰ (25 ng / l). El ODR-1 unidades promotor de expresión en el AWC y AWB amphid pares de neuronas, y el ofm-1 promotor de expresión en las unidades coelomocytes.
Someter a los animales transgénicos que expresan las matrices extracromosómicos detallado en el paso 1,2 para el ultravioleta (UV) / trimetilpsoraleno (TMP) protocolo de integración^11.
Bleach sincronizar los ¹² animales y cultivar en ellos el crecimiento de nematodos Medios (NGM) las placas que contenían E. OP50 coli a la etapa L4. Lave L4 animales en platos con NGM M9 tampón para eliminar E. OP50 bacterias coli.
Eliminar el tampón de M9 y añadir 50-100 l de 30 mg / ml de solución de trabajo TMP en el gusano pellet en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Envolver el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en papel de aluminio para bloquear la luz ambiental, y agitar suavemente en un agitador rotatorio durante 15 min en el embalaje flexible tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Transfiera los gusanos en la solución de TMP / gusano a una placa de NGM cabeza de serie grande.
Exponer a los gusanos en la placa de NGM a UV 350 μJ (X100) con un Stratalinker 2400. A continuación, añadir los gusanos a una placa que contiene NGM OP50 e incubar en la oscuridad durante 5 hr.
Elige 50 gusanos transgénicos para aproximadamente 10 placas sembradas (2-5 gusanos cada placa). Transferencia P0 es a las nuevas placas cada 24 horas durante 3 días.
Elige un 250 F1 clonalnimals (1 animal por placa). Clonar animales por 2-4 F2 de cada placa F1. Ver animales F3 para buscar una línea de transmisión 100% al ver la (p) ofm-1 :: patrón de expresión GFP bajo un microscopio de disección fluorescente.
Outcross la línea final integrado (s) con N2 animales de tipo salvaje 5 veces. Nos referiremos a la última línea integrada como pyIs500, y las buenas prácticas agrarias de etiquetado EGL-4 :: GFP molécula como EGL-4.

2. Cultivo y mantenimiento de animales para ensayos de translocación nuclear

Cultivar los animales pyIs500 a 25 ° C en placas estándar de 10 cm NGM (ver más abajo para obtener la receta) se sembró con OP50 E. bacterias coli ¹³ (Figura 1).
En el Día 1, recoger cuatro y cincuenta y seis L4 pyIs500 animales de placas cultivadas a 25 ° C en cinco separados 10 cm OP50 E. coli sembraron placas e incubar a 25 ° C (es decir, L4 4-5 animales por placa).
El día 4, lavar adulto populations pyIs500 de animales de las placas de NGM grandes usando S-basal tampón (ver más abajo para obtener la receta). Usar pipetas desechables de vidrio para transferir los animales, ya que se pegará a la parte de puntas de pipeta de plástico.

3. Olor a largo plazo inducida por la translocación nuclear ensayos

Lavar los animales pyIs500 3 veces en S-basal para eliminar las bacterias. No centrifugue los animales entre los mismos, sino que los animales puedan establecerse por gravedad en un tubo de microcentrífuga de 1,5 estacionario ml. Es crítico para asegurar que todas las bacterias se retira, y que los patés NGM están libres de contaminación, como las bacterias residuales afectará negativamente el resultado de la translocación de ensayo. Además, hemos encontrado que la esterilización en autoclave los tubos de 1,5 ml de microcentrífuga produce una "pegajosa" propiedad en las paredes interiores del tubo que hace que los animales se adhieren a los lados, y así utilizar no tratados en autoclave 1,5 ml tubos de microcentrífuga.
Mientras que los animales se están estableciendo entre los mismos, conforman tél adaptación solución. Añadir 100 ml de tampón de S-basal a un cilindro de 100 ml de graduación. Añadir la adaptación de olor a la S-basal y sellar el cilindro utilizando una banda de Parafilm ®. Si se realiza la adaptación benzaldehído añadir 7,5 l de benzaldehído a 100 ml de S-basal, para la adaptación butanona añadir 11 l de 2-butaone a 100 ml de S-basal. Invertir suavemente (no agitar) el cilindro graduado que contiene S-basales y olor 30 veces para crear una emulsión uniforme.
Después del lavado final en S-basal, que los animales puedan establecerse y eliminar todo el líquido. Etiquete un tubo "+ ve" o "adaptar" y el otro tubo "-ve" o "unadapt". A continuación, añadir 1 ml de la mezcla de la adaptación al tubo de microcentrífuga de adaptación (+ ve), y se añade 1 ml de S-basal al tubo de microcentrífuga de control no adaptado (-ve). Trate de mantener el número de animales entre 100 y 200 en cada tubo. Con un poco de práctica, es posible estimar el número aproximado de animales en un sedimento por ojo.
Coloque un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml tapón protectora cada tubo (impide que las tapas de hacer estallar abierto) y se colocan los tubos en un agitador rotatorio durante 80 min. Hemos encontrado que la exposición olor entre 60 min y 80 min produce resultados similares (ambos resultan en respuestas de adaptación a largo plazo). Sin embargo, 80 minutos de exposición proporciona resultados más consistentes en nuestras manos. Así, todos nuestros ensayos a largo plazo de adaptación están normalizados mediante el uso de una exposición min olor 80 (Figura 2).
Después de 80 minutos, lavar animales 3 veces en S-basal. Que los animales puedan establecerse por la gravedad entre cada lavado.

4. A corto plazo inducidos Odor-Ensayos de Translocación Nuclear

En el caso de la adaptación olor a corto plazo, utilizar el mismo protocolo como a largo plazo por los ensayos de translocación inducida olor-(Pasos 3.1-3.4), sin embargo en lugar de incubar los pyIs500 animales en la adaptación de olor para 80 min, utilizar una exposición min 30 . La cuantificación de la inducción de olor ensayos de translocación nuclear se describen a continuación (Etapa 5) es la misma a largo plazo y corto-term exposiciones.

5. Calificación del Evento olor inducida por la translocación nuclear

Hacer 2% de agarosa que contienen pastillas de 5 mM de azida sódica (NaN ₃₎ por disolución de electroforesis en gel de agarosa en dH ₂ 0. Coloque una sola gota de agarosa fundida que contiene NaN ₃ sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio. Inmediatamente colocar otro portaobjetos de microscopio de vidrio en la primera diapositiva para aplanar la gota de agarosa fundida. Dejar durante 30 segundos, y luego suavemente separar el portaobjetos dejando un portaobjetos de microscopio con una almohadilla plana de agarosa de ~ 1 mm.
Después del lavado final en S-basal, permita que los gusanos a instalarse en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y eliminar todo el líquido. A continuación, agregue los animales sabios de abandono en las almohadillas de agarosa de preparaciones microscópicas varios. Es importante mantener el número de animales de cada diapositiva para entre 50 y 100. Demasiados animales por diapositiva complicará puntuación y con frecuencia crean un resplandor después de la dispersión de la luz azul de excitación. El exceso de líquido puedeser malos de la almohadilla de agarosa utilizando un pequeño Kim-wipe. Poner un vaso de 0,5 mm cubreobjetos sobre la almohadilla y se deja reposar durante 2 minutos para permitir la NaN ₃ para inmovilizar a los animales. Nota, los animales pueden ser recuperados de las diapositivas después de la puntuación. Los animales se recuperan de la anestesia NaN ₃ después de ~ 1 hora si se transfiere a una placa sembrada NGM en una gota de buffer M9.
En este punto es imprescindible que cada experimentador idear una clave para rastrear qué diapositiva es el experimental (+ ve) diapositiva y diapositiva que es el control (-ve) diapositivas, las diapositivas y pasar a otra persona que ciegamente marcará el GFP: EGL-4 patrón de localización. Esto controlará cualquier sesgo experimentador.
Puntuación entre 50 y 100 animales por diapositiva utilizando un microscopio fluorescente vertical con los objetivos de aumento de 10X, 40X y 63X y filtros GFP / RFP. En primer lugar, localizar animales de menos de 10 aumentos con iluminación de campo brillante. En segundo lugar, localizar la neurona AWC apagando el bright-campo de iluminación y utilizando el filtro de RFP. (P) ODR-1 :: unidades DsRed expresión en las neuronas y AWB AWC. Las neuronas tienen AWC distintivos de células en forma de cuerpos ovalados, en comparación con los cuerpos celulares AWB que son más pequeños y de forma circular (Figura 2).
Una vez que el cuerpo de la célula AWC ha sido localizado, cambiar el filtro GFP y registrar la localización de las buenas prácticas agrarias: EGL-4 como la nuclear o citoplasmática. El uso de un contador permite al experimentador que seguir mirando por el ocular y anotó la diapositiva. Nota: 5.1-5.5 pasos se repiten al menos 3 veces en días diferentes para producir datos estadísticamente significativos (Figuras 1-2).

6. La supervisión, GFP-etiquetados EGL-4 durante la recuperación de la adaptación Olor a largo plazo

Después del paso 3,5, dividir las poblaciones de pyIs500 animales en múltiples alícuotas y la puntuación para GFP nuclear versus citoplásmica :: EGL-4 en la AWC punto en el tiempo cero (es decir, después de la exposición min 80) y multiple puntos de tiempo posteriores (Figura 3).
Transferir tanto el control (-ve) y animales experimentales (+ ve) usando pipetas desechables de vidrio en placas de NGM.
Permitir que los animales se recuperen durante varios períodos de tiempo y volver a examinar la localización de GFP :: EGL-4in AWC en cada punto de tiempo como en los pasos desde 5,1 hasta 5,5.

7. Materiales

Placas de NGM: Por 1 L añadir a 1 L ddH ₂ 0: 21 g de Bacto-Agar; 3 g Cloruro sódico (NaCl); 2,5 g de Bacto-peptona. Autoclave Media. Después del autoclave, enfriar el agar hasta que la temperatura se lee 54 ° C. Añadir las siguientes soluciones: 25 ml de 1 M tampón fosfato de potasio; 1 ml 1 M sulfato de magnesio (MgSO _4); 1 ml cloruro de calcio 1 M (CaCl _2); 1 ml de colesterol en etanol (5 mg / ml stock).

1 M dibásico K ₂ HPO ₄ 174.2 g / mol: Por 500 ml: En 400 ml ddH ₂ O, se disuelven 87,1 g Dibasic K ₂ HPO _4. Ajustar el volumen a 500 L con ddH ₂ O. Esterilizar por filtración utilizando un filtro de 500 ml Unidad estéril.

Monobásico 1 M KH ₂ PO ₄ 136.1 g / mol: Para 1 L: En 800 ml ddH ₂ O, se disuelven 136,1 g monobásico KH ₂ PO _4. Ajustar el volumen a 1 l con ddH ₂ O. Esterilizar por filtración utilizando un filtro de 500 ml Unidad estéril.

1 M de fosfato de potasio (K ₃ PO ₄₎ pH 6,0: Para 1 L: En un filtro de 1 L Unidad estéril, añadir 868 ml de 1 M KH ₂ PO ₄ monobásico. Deje que la unidad se filtre, a continuación, añadir 132 ml de 1 M dibásico K ₂ HPO _4. Deje que la unidad de filtrar todo el líquido. Retirar la unidad de filtro y ajustar el pH a 6,0. Almacenar a temperatura ambiente.

S-basal: Para 1 L: añadir 50 ml de 1M K ₃ PO ₄ Buffer, pH ~ 6,0, y 20 ml de 5 M NaCl _ac. Llene hasta 1 L conddH ₂ O. Autoclave de soluciones.

M9: Para 1 litro: 3 g de KH ₂ PO _4, 6 g de Na ₂ HPO _4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO _4, H ₂ O. Llenar hasta 1 L con ddH ₂ 0. Esterilizar en autoclave.