Trans-vivo hipersensibilidad de tipo retardada Ensayo para Antigen Reglamento Específico

Resumen

Se describe un ensayo de diagnóstico valiosa que potencialmente podría ser utilizado para decidir la retirada de la inmunosupresión después del trasplante sin riesgo elevado de rechazo del injerto. El ensayo utiliza los principios de la hipersensibilidad de tipo retardado y proporciona una evaluación precisa de ambos donantes respuestas inmunes efectoras y reglamentarias específicas montados por los destinatarios.

Resumen

Respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) es una rápida en la manifestación in vivo de la respuesta inmune dependiente de células T a un antígeno extraño (Ag) que el sistema inmune del huésped ha experimentado en el pasado reciente. Reacciones de DTH a menudo se dividen en una fase de sensibilización, en referencia a la experiencia inicial antígeno, y una fase de desafío, que por lo general sigue varios días después de la sensibilización. La falta de una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado a una recuperación Ag demostrada por pruebas cutáneas a menudo se considera como una prueba de anergia. El ensayo de DTH tradicional ha utilizado con eficacia en el diagnóstico de muchas infecciones microbianas.

A pesar de compartir características inmunológicas similares, tales como la infiltración de linfocitos, edema y necrosis de los tejidos, la DTH directa no es una técnica de diagnóstico factible en pacientes trasplantados debido a la posibilidad de inyección directa que resulta en la sensibilización a los antígenos del donante y la pérdida del injerto. Para evitar este problema, el zumbidouna-a-mouse "trans-vivo" ensayo de DTH fue desarrollado ^1,2. Esta prueba es esencialmente un ensayo de DTH de transferencia, en la que las células humanas mononucleares de sangre periférica (CMSP) y antígenos específicos se inyectaron por vía subcutánea en el pabellón auricular o pata de un ratón ingenuo e hinchazón DTH-como se mide después de 18-24 horas ^3. La presentación de antígenos por las células presentadoras de antígenos humanos, tales como los macrófagos o DCS a las células T en el tejido altamente vascular ratón desencadena la cascada inflamatoria y atrae a las células inmunes de ratón resultantes en las respuestas de hinchazón. La respuesta es antígeno-específica y requiere sensibilización previa antígeno. Una respuesta DTH donante-reactiva positiva en el ensayo de Tv-DTH refleja que el paciente de trasplante ha desarrollado una disposición inmune proinflamatoria hacia aloantígenos de injerto.

La característica más importante de este ensayo es que también se puede utilizar para detectar células T reguladoras, que provocan la supresión transeúnte. Supresión de un espectadorRespuesta de recuerdo DTH en la presencia de antígeno del donante es característica de los receptores de trasplante con aloinjertos aceptados ^2,4-14. El seguimiento de los pacientes trasplantados de alorreactividad y regulación por Tv-DTH puede identificar un subgrupo de pacientes que podrían beneficiarse de la reducción de la inmunosupresión y sin alto riesgo de rechazo o de la función renal deteriorada.

Un área prometedora es la aplicación del ensayo Tv-DTH en el monitoreo de la autoinmunidad ^15,16 y también en la inmunología tumoral ^17.

Protocolo

1. Preparación de los linfocitos

1. Recoger la sangre en tubos ACD (ácido citrato dextrosa).
2. Aislar PBMC de sangre periférica humana fresca usando medio de separación de linfocitos de acuerdo con métodos estándar.
3. Lavar las PBMC tres veces con PBS para eliminar las plaquetas contaminantes. Las plaquetas se encontraron para interferir con el ensayo de DTH trans-in vivo. Máxima permisible de contaminación por plaquetas preparación PBMC es ≤ 1x10 ⁷ / inyección.
4. Si hay una contaminación de células rojas de la sangre notable, lleve a cabo la lisis de glóbulos rojos usando tampón de lisis ACK después del primer lavado. Elimi....

Resultados

1. Evaluación de los receptores de trasplante renal para la respuesta específica de antígeno donante usando un ensayo Tv-DTH

Para probar el donante reactivo con la inmunidad celular en los receptores de trasplante renal se inyecta PBMC de estos pacientes con antígenos del donante solo o con un antígeno de recuerdo del toxoide tetánico (TT). Como células de control positivo fueron inyectados sólo con TT. Observamos tres patrones principales de hipersensibilidad de tipo retardado en los receptore.......

Discusión

El ensayo de DTH trans-vivo es una prueba de diagnóstico novela con una aplicación clínica potencial en la evaluación de las respuestas mediadas por células en trasplante, pacientes de cáncer y autoinmunes. Es valioso porque no sólo es útil en el seguimiento de las respuestas de recuerdo T efectoras, sino que también puede detectar respuestas T reguladoras. Un método confiable para detectar la regulación DTH humano puede predecir la seguridad de la retirada de inmunosupresión en los pacientes que son candidatos a la mon.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo ACD para la recolección de sangre	BD	02-684-26
Medio para la separación de linfocitos	Cellgro	25-072-CV
Solución salina tamponada con fosfatos de Dulbecco	Cellgro	21-031-CM	Sin calcio &y magnesio
Tampón de lisis ACK	BioWhittaker	10-548E
TT/DT o VEB	Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc.		TT/DT 25 μg/inyección VEB 8 μg/inyección
Inhibidor de proteasas PMSF	Sigma-Aldrich	78830
Eosina para recuento de células	Sigma-Aldrich	E-6003
Aloantígeno			Antígenos HLA purificados, péptidos aloinmunes sintéticos pueden utilizarse en lugar de lisados libres de células donantes
Tubos centrífugos estériles de 50 ml	Fisher Scientific	06-443-18
Pipetas de 10 ml y pipetador	BD Falcon	13-675-20
tubos seguros de 2 ml	Costar	3213
1000 μl, 100 μl , 10 μl pipetas con puntas estériles
Hemocitómetro	Fisher	02-671-10
Centrífuga de tamaño completo y microcentrífuga	Beckman Coulter/Eppendorf
Jeringas de insulina de 1/2 cc o 1 cc	Becton Dickinson	14-826-79	calibre 28
Vibracell sonicador	Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc		sonda de 2 mm
Medidor de grosor con dial	Mitutoyo, Japón
ratones SCID	Harlan
Isoflurano	Piramal Healthcare		Anestesia inhalatoria