Los explantes blastómeras para la Prueba de Compromiso destino celular durante el desarrollo embrionario

Resumen

El destino de una célula embrionaria individual puede ser influenciada por las moléculas hereditarias y / o por las señales de las células vecinas. Utilizando los mapas de destino de la etapa de escisión de embriones de Xenopus, blastómeras individuales pueden ser identificados por la cultura de forma aislada para evaluar las contribuciones de moléculas hereditarias frente a las interacciones célula-célula.

Resumen

Mapas de Destino, construidas a partir de linaje rastreo de todas las células de un embrión, revelan que los tejidos descienden de cada célula del embrión. Aunque los mapas destino son muy útiles para la identificación de los precursores de un órgano y para elucidar la vía de desarrollo por el que las células descendientes rellenar ese órgano en el embrión normal, no ilustran el potencial de desarrollo de una célula precursora o identificar los mecanismos por los cuales su destino está determinado. Para poner a prueba el compromiso del destino celular, se compara repertorio normal de una célula de descendientes en el embrión intacto (el mapa de destino) con los que se expresan después de una manipulación experimental. Es el destino de la célula fija (comprometido), independientemente del entorno celular, o es influenciado por factores externos facilitados por sus vecinos? Usando los mapas completos destino del embrión de Xenopus, se describe cómo identificar, aislar y única cultura precursores estadio de división, llamado blastomeres. Este enfoque permite evaluar si estas células tempranas están comprometidos con el destino que adquieren en su entorno normal en el embrión intacto, requieren interacciones con sus células vecinas, o puede ser influenciada para expresar destinos alternativos, si expuesto a otros tipos de señales.

Introducción

Xenopus laevis embriones se han utilizado ampliamente para identificar los mecanismos por los cuales las células embrionarias adquieren sus destinos específicos debido a que sus huevos son lo suficientemente grandes para permitir que los enfoques de microcirugía. Además, se desarrollan de forma externa sin la necesidad de suplementación nutricional del medio de cultivo debido a que cada célula contiene un rico suministro intracelular de las plaquetas de yema de que proporcionan una reserva de energía intrínseca. Un activo importante para el estudio de los mecanismos por los cuales se determina el destino celular es el conjunto completo de mapas de destino de....

Protocolo

1. Preparación de los medios de comunicación, Cultura Instrumentos y platos

1. Enfocar cuatro pinzas con película abrasivo de alúmina. Haga esto bajo un microscopio de disección para controlar el tamaño de la punta. Un par de pinzas sirve como una copia de seguridad en caso de que una punta se daña durante el procedimiento. Autoclave las cuatro pinzas y almacenar en un recipiente estéril.
2. Hacer cada 500 ml de medio de cultivo 0,1 X 1,0 X y (ya sea modificado de Marc Ringers [MMR] o salinos Modificado Barth [MBS]; recetas en ¹⁵⁾ y el filtro de esterilización. Habitualmente usamos MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl _2, 1 ....

Resultados

La capacidad de este ensayo para evaluar con precisión el potencial de desarrollo de la célula se basa en la disección de la blastómero correcto basado en el destino mapas ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Por lo tanto, es fundamental para elegir embriones con el patrón de pigmentación correcta en la etapa 2-células, como se ilustra en la Figura 1, que posteriormente se ajustan a los patrones de escisión regulares, como se ilustra en la Figura 2. Si se observa según los embriones a medida qu.......

Discusión

Los pasos más críticos para el cultivo con éxito de blastómeros individuales son: 1) identificar correctamente el blastómero de interés, 2) el mantenimiento de un cultivo estéril, saludable y 3) células de disección en la parte correcta del ciclo celular, y 4) la elaboración del manual necesario destreza para evitar daños durante la disección y transferir a la cultura también.

Para manipular blastómeras específicas, es esencial para ser capaz de identificar los ejes cardinales. En embriones .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Película abrasivo de alúmina	Thomas Scientific	# 6775E-38	Campo (12 micras), para grandes reparaciones de puntas de las pinzas
Película abrasivo de alúmina	Thomas Scientific	# 6775E-46	Medio (3 m), para bien afilado de puntas de las pinzas
Película abrasivo de alúmina	Thomas Scientific	# 6775E-54	Fine (0,3 m), para el pulido de puntas de las pinzas
Pinzas: Dumont, Dumoxel Biologie # 5	Herramientas Artes Ciencias	# 11252-30	Estos tienen las puntas finas que no necesitan ser afilados cuando se adquirió. Resistente a la corrosión, para que puedanse esteriliza en autoclave.
La gentamicina solución	Sigma	G1397	Añadir al medio en el mismo día de uso