En Expression in ovo de microARN en ventral del polluelo Midbrain

Resumen

La expresión ectópica es una técnica para dilucidar el papel microRNAs en el desarrollo del cerebro. Sin embargo, la focalización en áreas específicas mediante electroporación in ovo es un reto. Aquí, se muestra una forma eficiente a las regiones del cerebro medio ventral y dorsal selectiva electroporar.

Resumen

RNAs no codificantes son jugadores adicionales en la regulación de la expresión génica. Dirigida en la electroporación in ovo de áreas específicas proporciona una herramienta única para el control espacial y temporal de la expresión de microARN ectópico. Sin embargo, las estructuras del cerebro como ventrales del cerebro medio ventral son más bien difíciles de alcanzar para cualquier manipulaciones. Este sentido, demuestran una forma eficiente de electroporar miRNA en el mesencéfalo ventral usando electrodos de platino delgada. Este método ofrece una forma fiable para transfectar las áreas específicas del cerebro medio y una herramienta útil para los estudios in vivo.

Introducción

El reconocimiento de los ARN no codificantes pequeños como reproductores adicionales para la expresión de genes lanzó una nueva complejidad a la regulación genómica de programación / gen. Las diferentes especies de RNAs no codificantes tienen importancia funcional en las células neuronales, incluidos los pequeños no codificante RNAs ^1-4. Los microARN (miR o miARN), por ejemplo, muestran distintos perfiles de expresión y los cambios en los cerebros en desarrollo ^5. Dirigida en la electroporación in ovo de embriones de pollo ofrece una oportunidad única para el control temporal y espacial de la expresión génica y el silenciamient....

Protocolo

1. Requisitos para la electroporación in ovo

1. Preparación de la construcción del vector: sentido y antisentido mir primers fueron diseñados después de las instrucciones de Ambion, recocidas y se ligaron en ApaI / EcoRI digerido pSilencer pSilencer U6.1 vector. Después de la transformación con éxito uno de los clones resultantes se cultivó y el plásmido pSilencer pSilencer se aisló por el método de lisis alcalina utilizando un kit de preparación de MIDI Quiagen.
2. Electrodos: Los electrodos se pueden comprar o fácilmente se construirán ^13. Utilizamos electrodos hechos a sí mismos de alambre de pla....

Resultados

La extensión de la zona del cerebro medio transfectadas con MIR es visible a través de la expresión de GFP a partir de un vector indicador inyectado junto con el vector de expresión de miR (Figura 2). El uso de electrodos de platino con un diámetro de 0,5 mm y colocado paralelo al eje de AP de cables del cerebro medio normalmente a la transfección de una zona amplia a lo largo de la-y DV AP-eje, incluyendo rombencéfalo, mesencéfalo y diencéfalo veces (Figuras 2A y B). El tamaño de los e.......

Discusión

Este video muestra un método eficaz para transfectar plásmido en las células neuroepiteliales de áreas específicas del cerebro medio pollito. Pulsos eléctricos rectangulares de baja tensión pueden introducir ADN en las células del tubo neural de pollo in ovo ^6,16. Sin embargo, la exactitud de la focalización de ADN a menudo se ve obstaculizada por el campo eléctrico de ancho, que se eleva a través de los electrodos relativamente grandes (Φ = 0,5 mm). Hemos tratado de hacer frente a ese problema media.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Capilares de vidrio de borosilicato	Hartenstein		Modelo: 0,9 mm
Extractor de microcapilares	WPI, Berlín		Modelo: Pul1-E
Electroporador	Intracel		Modelo: TSSIC
Microscopio estereoscópico - fluorescencia	LEICA		Modelo: MZFLIII
Microscopio estereoscópico	Zeiss		Modelo: Stemi
Cámara y software	Zeiss		Modelo: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8