Evaluación de Generación de la Fuerza isométrica y excéntrica de los músculos esqueléticos Aislados de modelos murinos de Distrofias Musculares

Mediciones de función muscular contribuir a la evaluación de tratamientos potenciales para la patología muscular, así como para la determinación de los mecanismos subyacentes a la fisiología de este tejido. Para la enfermedad muscular, el uso de modelos de ratones se han convertido en un componente central para la comprensión de los vínculos entre el genotipo y el fenotipo, y para ampliar el conocimiento en el diseño y prueba de productos terapéuticos potenciales. Las distrofias musculares, en particular, se han basado en ratones para evaluar estos agentes y establecer los datos preclínicos necesarios para avanzar a los ensayos en pacientes. Una medida de resultado frecuente utiliza la función muscular aislado para determinar la fuerza, que es aplicable a una amplia gama de estudios. Otra medida es el uso de excéntrica, o el alargamiento, las contracciones para determinar cambios en la integridad de la membrana muscular, que es deficiente en la distrofia muscular de Duchenne, y el modelo de ratón de esta enfermedad (mdx). Por lo tanto, es esencial para este tipo de measurempadres a ser sensible y reproducible.

El ratón extensor digitorum longus (EDL) se ha utilizado ampliamente para la función muscular aislado debido a su geometría ideal y tamaño, incluyendo la orientación de fibra uniforme y tendones definitivos ^{2, 5, 6, 10, 12.} Métodos para músculos EDL isométricas medidas funcionales se han descrito en una publicación anterior JoVE ^8, así como en el SOP Treat-NMD ^1. Hemos extendido la descripción de estos métodos para incluir tanto las contracciones isométricas y excéntrica. Características de la enfermedad son evidentes en la EDL, incluidos los ciclos heighted de degeneración / regeneración y producción de fuerza disminuida.

El diafragma de ratón muestra la progresión patológica más rápido de la distrofia muscular en comparación con otros músculos en el ratón ^11. A los 6 meses de edad, fibrosis acumulada comprende aproximadamente el 50% del músculo. Esto da como resultado significativamente impaired fuerza de salida ^11. Por lo tanto, los agentes terapéuticos que pueden prevenir la infiltración fibrótica se puede evaluar de manera eficiente en el diafragma.

La pérdida de distrofina en el músculo conduce a mayor fragilidad y el daño contráctil aumentado en todos los ⁹ músculos. Por lo tanto muchas terapias para la distrofia muscular de Duchenne están orientados para el reemplazo de la distrofina. Como tal, un ensayo que se ha convertido en esencial para la evaluación de estas estrategias es la contracción excéntrica, que puede distinguir entre el músculo normal y distrófico, así como determinar qué beneficios de una estrategia particular ha de proteger a un músculo distrófico de daño contráctil ^{2, 3, 4, 12.} Este procedimiento requiere o bien un modo dual servo-motor que puede modular / longitud del registro y la fuerza, o un método de ajuste de longitud rápidamente separado de un transductor de fuerza.

Todos los procedimientos fueron revisados ​​y aprobados por la Universidad de Pennsylvania IACUC.

1. La disección y preparación del EDL (Aproximadamente 30 minutos)

1. Anestesiar los ratones para asegurar que no experimentan dolor o malestar durante el procedimiento, pero que los músculos permanecen bien oxigenada por la circulación. Habitualmente usamos un cóctel de ketamina / xilazina (100/10 mg / kg) inyectado a través de IP. Plano quirúrgico de anestesia se determina por la ausencia completa de pedal o reflejos palpedral de abstinencia, o la falta de respuesta del oído contracción.
2. Inmovilizar las extremidades posteriores utilizando cinta médica, y quitar la piel de las patas traseras anterior inferior para exponer los músculos de esta zona. Mantener los músculos húmeda con la aplicación de PBS a intervalos regulares.
3. Bajo un microscopio de disección, hacer una pequeña incisión lateral a la rodilla con el fin de exponer el tendón proximal del músculo EDL. Hay dos tendones en esta región, y ambos deben ser cortadas para permitir reremoción de la EDL.
4. En el tobillo medial, cortar el tendón del músculo TA para exponer los tendones distales de la EDL, que se extienden a lo largo de los tarsales meta. Levante el músculo TA fuera del camino, teniendo cuidado de no cortar ni tocar la parte de abajo EDL. Volver a los tendones distales de la EDL, recorte cada uno y llevarlos a través del tobillo, y luego agarrar los tendones, tire suavemente de la EDL lejos del resto de la extremidad. Se debe liberar desde el extremo proximal libremente, pero si no, volver a la incisión lateral para asegurar que el tendón se corta. Retire el músculo y colocar en un plato lleno de disección refrigerados Ringers oxigenados. Pin el músculo a través de los tendones en longitud aproximadamente de reposo, que es la longitud observada in vivo. La longitud es demasiado corto cuando el músculo está flácido en el plato, y demasiado largo si el músculo está tirando de los pasadores de disección.
5. Sacrificar al ratón inmediatamente después de la extracción del músculo por dislocación cervical.
6. Ate las suturas de los diezDons, tan cerca como sea posible del músculo, pero sin tocar el músculo. Pin el músculo en reposo longitud aproximadamente con las suturas.

2. Diafragma de disección y preparación (aproximadamente 30 minutos)

1. Eutanasia a los ratones antes de este procedimiento por dislocación cervical bajo anestesia, si el mismo ratón se somete a ambos disecciones, o por CO ₂ seguido por la confirmación con dislocación cervical.
2. Hacer una incisión en la piel para exponer la cavidad abdominal y el pecho. Abrir la cavidad abdominal, y cortar la pared del cuerpo justo debajo de las costillas. Con una tijera de hueso, y comenzando por encima de la inserción del diafragma, corte alrededor de toda la caja torácica siguiendo la línea de las costillas, y corte a través de la columna vertebral. Cortar los vasos sanguíneos que atraviesan el centro del diafragma de modo que el diafragma se puede quitar fácilmente.
3. Retire el diafragma del ratón, y colocar en un plato lleno de disección Ringers oxigenados. Agite suavemente la diaphragm en el plato para lavar la sangre. Actualizar solución Ringer, según sea necesario.
4. Cortar una tira pequeña de la membrana desde el tendón central a las costillas a lo largo de la orientación de las fibras en la porción central de los hemidiafragmas laterales. La tira debe estar entre 2-4 mm de ancho. Usando tijeras de hueso, cortar el nervio a cada lado de la tira, dejando aproximadamente 1-2 mm de nervio saliente a cada lado de la tira de membrana.
5. Atar las suturas en el tendón central. Ligado de suturas a cada uno de los extremos costales que sobresalen lateralmente, y después unir estos juntos para hacer un bucle grande.
6. Dos tiras se pueden obtener de cualquier diafragma dado (uno de cada lado).

3. Los músculos de montaje en Bath Mecánica

1. Agarre las suturas y utilizar éstos para unir el músculo a un poste rígido en un extremo, y a un transductor de fuerza en el otro extremo.
2. Ajuste de la longitud para asegurar que el músculo no está floja, pero no es tensa. Una buena aproximación es la musc reposole longitud como en 1.4 - 1.5.
3. Del baño debe ser llenado con solución de Ringer oxigenada mantenida a 22 ° C para prolongar la estabilidad de músculo para la prueba. Músculos debe descansar durante 5 min en este baño antes de la prueba funcional de modo que la temperatura del músculo se equilibra a 22 ° C.

4. Las contracciones isométricas

1. Establecer condiciones supramáximos estimulación. Después de un músculo se coloca en el baño, de un solo uso pulsos de estimulación 0,5 mseg para generar una contracción, y supervisar la salida de fuerza. Poco a poco aumentar la corriente hasta que la fuerza alcanza un nivel máximo pero constante. Aumentar la corriente a más del 10% de este nivel durante el resto de experimentos.
2. Establecer longitud óptima. Uso de estímulos de contracción isométrica, ajustar la longitud del músculo gradualmente hasta una fuerza máxima se obtiene. Apoye el músculo ~ 10 segundos entre cada contracción. Longitud muscular óptimo _(o L) se logra cuando la fuerza de contracción es máxima. Grabar la longitud muscular (la longitud seaentre las uniones miotendinosa de EDL, y entre el centro de unión del tendón miotendinosa y la inserción de los músculos a la costilla) con pie de rey.
3. Fuerza máxima isométrica tetánica. Estimular el músculo fijado en L _o por un periodo de 500 milisegundos, con una serie de pulsos de 0,5 ms en la estimulación supramáxima y en la frecuencia de fusión (de la meseta de la relación fuerza-frecuencia (por ejemplo, Ref.:. ⁸⁾ La meseta de los músculos EDL es normalmente se logra con 120 Hz, y para los músculos del diafragma con 100 Hz. Estimular 3 veces a la frecuencia correspondiente, con periodos de descanso de 5 minutos entre las series de estimulación para cada músculo.

5. Las contracciones excéntricas

1. Permita que los músculos para descansar 5 minutos entre realizar contracciones isométricas y excéntrico.
2. Estimular los músculos a 80 Hz isométricamente para la inicial 500 ms, seguido de un 10% de estiramiento L _o en el final de la estimulación 200 mseg (una velocidad de estiramiento de 0,5 L _o/ Seg).
3. Repetir patrón de estimulación con 5 min descansa entre el número deseado de las contracciones excéntricas.
4. Medir la fuerza de cada contracción en el período de tiempo antes de que el estiramiento. Cálculo de la caída de la fuerza de contracción entre el primero y el último.

6. Músculo Retiro del aparato

1. Acortar la longitud de los músculos para permitir la eliminación suave de los músculos del transductor y publicar y devolverlo a un plato de disección con timbres.
2. Retirar las suturas de los músculos.
3. Para el músculo EDL, secar el músculo dos veces, luego se pesan, antes de tratamiento posterior (por ejemplo, congelación, fijación, etc.) Esto será importante para el cálculo del área de sección transversal, y la fuerza específica.
4. Para el músculo diafragma, de inmersión en 0,1% Procion naranja, un tinte membrana impermeabilizante durante 15-20 min. Esto proporcionará un índice de daño disección.
5. Diseccionar el músculo lejos de la inserción ósea, así como la cientotendón ral. Esto es necesario para proporcionar un peso exacto del músculo. Seque el anterior antes del pesaje y posterior elaboración del mismo.
6. Cálculo de área de sección transversal (CSA):
   CSA (mm ²⁾ = masa (mg) / [(L _o mm) * (L / L _o) * (1,06 mg / mm ^3)],
   donde L / L _o es el cociente del músculo de fibra a la longitud (0,45 para EDL, 1,0 para el diafragma) ⁵ y 1,06 es la densidad del músculo.

Los valores esperados para las fuerzas isométricas de músculos EDL de 12 semanas de edad los animales se muestran en la figura 1. Dado que los músculos mdx exponer hipertrofia compensatoria, la fuerza tetánica total puede ser mayor en los músculos mdx en comparación con controles emparejados por edad de tipo salvaje. Sin embargo, una medida más apropiada de la salida funcional es la fuerza específica (Figura 2), donde la fuerza se normaliza para el área transversal para calcular este valor. Fuerza específica depende de la capacidad inherente funcional del músculo, donde la debilidad en los músculos distróficos es más evidente cuando tanto la fuerza absoluta y área de sección transversal se tienen en cuenta. En nuestras manos, músculos EDL de ratones mdx generan aproximadamente 20 a 25% más bajas que las fuerzas específicas de la misma edad ratones de tipo salvaje 10 a 26 semanas de edad.

Para que el diafragma, solamente la fuerza específica es pertinente para las comparaciones porque la preparación es una pieza del músculo dependiente de la dissección. Comparación de la fuerza específica entre wildtype y músculos mdx diafragma refleja la patología progresiva en este tejido. Producción de fuerza isométrica disminuye con la edad (Figura 3), de modo que a los 6 meses de edad, los músculos del diafragma de ratones mdx no producen más de la mitad de la salida funcional de las tiras de membrana de edad con ajuste los controles de tipo salvaje.

Un ejemplo de las contracciones excéntricas de las pruebas de diafragma se muestra en la Figura 4. Con cada contracción excéntrica posterior, disminuye la producción de fuerza en las tiras de membrana, tanto de tipo salvaje (C57) y ratones mdx. Sin embargo, la pérdida de la fuerza es más dramático en muestras de músculo de ratón mdx, presumiblemente a partir de la ausencia de distrofina y sus proteínas asociadas.

Figura 1. Fuerza isométrica tetánica en wildtype y EDL músculos mdx f Rm 12 semanas de edad ratones. Fuerza absoluta puede ser mayor en la misma edad mdx músculos EDL debido a la hipertrofia compensatoria.

Figura 2. Isométrica fuerza tetánica normalizado por área de sección transversal del músculo es la fuerza específica, y revela la capacidad deprimido funcional de los músculos EDL de ratones mdx, en comparación con los de los ratones de tipo salvaje. Las huellas son de los mismos ratones como en la figura 1.

Figura 3. La pérdida progresiva de la capacidad de generación de fuerza evaluada por la fuerza específica es más evidente en el diafragma de ratones mdx (barras rojas) en comparación con los de tipo salvaje (C57 en línea azul).

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Figura 4. La pérdida de la fuerza como una función del número contracción excéntrica de los músculos del diafragma de 12 semanas de edad C57 y ratones mdx. Los datos son la media ± SEM para N = 4 músculos por genotipo.

La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por Aurora Científico.