Evaluación de Generación de la Fuerza isométrica y excéntrica de los músculos esqueléticos Aislados de modelos murinos de Distrofias Musculares

Resumen

Mediciones de función muscular contribuir a la evaluación de agentes terapéuticos potenciales para patología muscular, así como para la determinación de los mecanismos subyacentes a la fisiología de este tejido. Vamos a demostrar la preparación del extensor largo de los dedos y los músculos del diafragma para la prueba funcional. Los protocolos para las contracciones isométricas y excéntrico se muestra, así como las diferencias en los resultados entre los músculos distróficos, que representan un estado patológico, y los músculos de tipo salvaje.

Resumen

Crítica para la evaluación de agentes terapéuticos potenciales para la enfermedad muscular son evaluaciones fisiológicas sensibles y reproducibles de la función muscular. Debido a que muchos ensayos pre-clínicos se basan en modelos de ratón para estas enfermedades, la función muscular aislado se ha convertido en uno de los estándares de Pasa / No Pasa decisiones en el movimiento de los fármacos candidatos con interés en los pacientes. Vamos a demostrar la preparación del extensor digitorum longus (EDL) y los músculos del diafragma para las pruebas funcionales, que son los músculos predominantes utilizados para estos estudios. La geometría del músculo EDL es ideal para preparaciones de músculo aisladas, con dos tendones de fácil acceso, y un tamaño pequeño que puede ser soportada por superfusión en un baño. El diafragma presenta una profunda patología progresiva en animales distróficos, y puede servir como una plataforma para la evaluación de muchas terapias potenciales lucha contra la fibrosis y la promoción de la estabilidad de miofibras. Los protocolos para las pruebas de rutina, incluyendo isométrico y ECCENtricas, las contracciones serán mostrados. Fuerza isométrica proporciona una evaluación de la fuerza, y las contracciones excéntricas ayudar a evaluar la estabilidad del sarcolema, que se rompe en muchos tipos de distrofias musculares. Las comparaciones de los resultados esperados entre los músculos de los músculos de tipo salvaje y distrófica también se proporcionará. Estas medidas pueden complementar las mediciones morfológicas y bioquímicas de la homeostasis del tejido, así como evaluaciones de enteros de animales de la función muscular.

Introducción

Mediciones de función muscular contribuir a la evaluación de tratamientos potenciales para la patología muscular, así como para la determinación de los mecanismos subyacentes a la fisiología de este tejido. Para la enfermedad muscular, el uso de modelos de ratones se han convertido en un componente central para la comprensión de los vínculos entre el genotipo y el fenotipo, y para ampliar el conocimiento en el diseño y prueba de productos terapéuticos potenciales. Las distrofias musculares, en particular, se han basado en ratones para evaluar estos agentes y establecer los datos preclínicos necesarios para avanzar a los ensayos en pacientes. Una medida de resultado frecuente utiliza la función muscular aislado para determinar la fuerza, que es aplicable a una amplia gama de estudios. Otra medida es el uso de excéntrica, o el alargamiento, las contracciones para determinar cambios en la integridad de la membrana muscular, que es deficiente en la distrofia muscular de Duchenne, y el modelo de ratón de esta enfermedad (mdx). Por lo tanto, es esencial para este tipo de measurempadres a ser sensible y reproducible.

El ratón extensor digitorum longus (EDL) se ha utilizado ampliamente para la función muscular aislado debido a su geometría ideal y tamaño, incluyendo la orientación de fibra uniforme y tendones definitivos ^{2, 5, 6, 10, 12.} Métodos para músculos EDL isométricas medidas funcionales se han descrito en una publicación anterior JoVE ^8, así como en el SOP Treat-NMD ^1. Hemos extendido la descripción de estos métodos para incluir tanto las contracciones isométricas y excéntrica. Características de la enfermedad son evidentes en la EDL, incluidos los ciclos heighted de degeneración / regeneración y producción de fuerza disminuida.

El diafragma de ratón muestra la progresión patológica más rápido de la distrofia muscular en comparación con otros músculos en el ratón ^11. A los 6 meses de edad, fibrosis acumulada comprende aproximadamente el 50% del músculo. Esto da como resultado significativamente impaired fuerza de salida ^11. Por lo tanto, los agentes terapéuticos que pueden prevenir la infiltración fibrótica se puede evaluar de manera eficiente en el diafragma.

La pérdida de distrofina en el músculo conduce a mayor fragilidad y el daño contráctil aumentado en todos los ⁹ músculos. Por lo tanto muchas terapias para la distrofia muscular de Duchenne están orientados para el reemplazo de la distrofina. Como tal, un ensayo que se ha convertido en esencial para la evaluación de estas estrategias es la contracción excéntrica, que puede distinguir entre el músculo normal y distrófico, así como determinar qué beneficios de una estrategia particular ha de proteger a un músculo distrófico de daño contráctil ^{2, 3, 4, 12.} Este procedimiento requiere o bien un modo dual servo-motor que puede modular / longitud del registro y la fuerza, o un método de ajuste de longitud rápidamente separado de un transductor de fuerza.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron revisados ​​y aprobados por la Universidad de Pennsylvania IACUC.

1. La disección y preparación del EDL (Aproximadamente 30 minutos)

1. Anestesiar los ratones para asegurar que no experimentan dolor o malestar durante el procedimiento, pero que los músculos permanecen bien oxigenada por la circulación. Habitualmente usamos un cóctel de ketamina / xilazina (100/10 mg / kg) inyectado a través de IP. Plano quirúrgico de anestesia se determina por la ausencia completa de pedal o reflejos palpedral de abstinencia, o la falta de respuesta del oído contracción.
2. Inmovilizar las extremidades posteriores utilizando cinta médica, y quitar la piel de las patas traseras anterior inferior para exponer los músculos de esta zona. Mantener los músculos húmeda con la aplicación de PBS a intervalos regulares.
3. Bajo un microscopio de disección, hacer una pequeña incisión lateral a la rodilla con el fin de exponer el tendón proximal del músculo EDL. Hay dos tendones en esta región, y ambos deben ser cortadas para permitir reremoción de la EDL.
4. En el tobillo medial, cortar el tendón del músculo TA para exponer los tendones distales de la EDL, que se extienden a lo largo de los tarsales meta. Levante el músculo TA fuera del camino, teniendo cuidado de no cortar ni tocar la parte de abajo EDL. Volver a los tendones distales de la EDL, recorte cada uno y llevarlos a través del tobillo, y luego agarrar los tendones, tire suavemente de la EDL lejos del resto de la extremidad. Se debe liberar desde el extremo proximal libremente, pero si no, volver a la incisión lateral para asegurar que el tendón se corta. Retire el músculo y colocar en un plato lleno de disección refrigerados Ringers oxigenados. Pin el músculo a través de los tendones en longitud aproximadamente de reposo, que es la longitud observada in vivo. La longitud es demasiado corto cuando el músculo está flácido en el plato, y demasiado largo si el músculo está tirando de los pasadores de disección.
5. Sacrificar al ratón inmediatamente después de la extracción del músculo por dislocación cervical.
6. Ate las suturas de los diezDons, tan cerca como sea posible del músculo, pero sin tocar el músculo. Pin el músculo en reposo longitud aproximadamente con las suturas.

2. Diafragma de disección y preparación (aproximadamente 30 minutos)

1. Eutanasia a los ratones antes de este procedimiento por dislocación cervical bajo anestesia, si el mismo ratón se somete a ambos disecciones, o por CO ₂ seguido por la confirmación con dislocación cervical.
2. Hacer una incisión en la piel para exponer la cavidad abdominal y el pecho. Abrir la cavidad abdominal, y cortar la pared del cuerpo justo debajo de las costillas. Con una tijera de hueso, y comenzando por encima de la inserción del diafragma, corte alrededor de toda la caja torácica siguiendo la línea de las costillas, y corte a través de la columna vertebral. Cortar los vasos sanguíneos que atraviesan el centro del diafragma de modo que el diafragma se puede quitar fácilmente.
3. Retire el diafragma del ratón, y colocar en un plato lleno de disección Ringers oxigenados. Agite suavemente la diaphragm en el plato para lavar la sangre. Actualizar solución Ringer, según sea necesario.
4. Cortar una tira pequeña de la membrana desde el tendón central a las costillas a lo largo de la orientación de las fibras en la porción central de los hemidiafragmas laterales. La tira debe estar entre 2-4 mm de ancho. Usando tijeras de hueso, cortar el nervio a cada lado de la tira, dejando aproximadamente 1-2 mm de nervio saliente a cada lado de la tira de membrana.
5. Atar las suturas en el tendón central. Ligado de suturas a cada uno de los extremos costales que sobresalen lateralmente, y después unir estos juntos para hacer un bucle grande.
6. Dos tiras se pueden obtener de cualquier diafragma dado (uno de cada lado).

3. Los músculos de montaje en Bath Mecánica

1. Agarre las suturas y utilizar éstos para unir el músculo a un poste rígido en un extremo, y a un transductor de fuerza en el otro extremo.
2. Ajuste de la longitud para asegurar que el músculo no está floja, pero no es tensa. Una buena aproximación es la musc reposole longitud como en 1.4 - 1.5.
3. Del baño debe ser llenado con solución de Ringer oxigenada mantenida a 22 ° C para prolongar la estabilidad de músculo para la prueba. Músculos debe descansar durante 5 min en este baño antes de la prueba funcional de modo que la temperatura del músculo se equilibra a 22 ° C.

4. Las contracciones isométricas

1. Establecer condiciones supramáximos estimulación. Después de un músculo se coloca en el baño, de un solo uso pulsos de estimulación 0,5 mseg para generar una contracción, y supervisar la salida de fuerza. Poco a poco aumentar la corriente hasta que la fuerza alcanza un nivel máximo pero constante. Aumentar la corriente a más del 10% de este nivel durante el resto de experimentos.
2. Establecer longitud óptima. Uso de estímulos de contracción isométrica, ajustar la longitud del músculo gradualmente hasta una fuerza máxima se obtiene. Apoye el músculo ~ 10 segundos entre cada contracción. Longitud muscular óptimo _(o L) se logra cuando la fuerza de contracción es máxima. Grabar la longitud muscular (la longitud seaentre las uniones miotendinosa de EDL, y entre el centro de unión del tendón miotendinosa y la inserción de los músculos a la costilla) con pie de rey.
3. Fuerza máxima isométrica tetánica. Estimular el músculo fijado en L _o por un periodo de 500 milisegundos, con una serie de pulsos de 0,5 ms en la estimulación supramáxima y en la frecuencia de fusión (de la meseta de la relación fuerza-frecuencia (por ejemplo, Ref.:. ⁸⁾ La meseta de los músculos EDL es normalmente se logra con 120 Hz, y para los músculos del diafragma con 100 Hz. Estimular 3 veces a la frecuencia correspondiente, con periodos de descanso de 5 minutos entre las series de estimulación para cada músculo.

5. Las contracciones excéntricas

1. Permita que los músculos para descansar 5 minutos entre realizar contracciones isométricas y excéntrico.
2. Estimular los músculos a 80 Hz isométricamente para la inicial 500 ms, seguido de un 10% de estiramiento L _o en el final de la estimulación 200 mseg (una velocidad de estiramiento de 0,5 L _o/ Seg).
3. Repetir patrón de estimulación con 5 min descansa entre el número deseado de las contracciones excéntricas.
4. Medir la fuerza de cada contracción en el período de tiempo antes de que el estiramiento. Cálculo de la caída de la fuerza de contracción entre el primero y el último.

6. Músculo Retiro del aparato

1. Acortar la longitud de los músculos para permitir la eliminación suave de los músculos del transductor y publicar y devolverlo a un plato de disección con timbres.
2. Retirar las suturas de los músculos.
3. Para el músculo EDL, secar el músculo dos veces, luego se pesan, antes de tratamiento posterior (por ejemplo, congelación, fijación, etc.) Esto será importante para el cálculo del área de sección transversal, y la fuerza específica.
4. Para el músculo diafragma, de inmersión en 0,1% Procion naranja, un tinte membrana impermeabilizante durante 15-20 min. Esto proporcionará un índice de daño disección.
5. Diseccionar el músculo lejos de la inserción ósea, así como la cientotendón ral. Esto es necesario para proporcionar un peso exacto del músculo. Seque el anterior antes del pesaje y posterior elaboración del mismo.
6. Cálculo de área de sección transversal (CSA):
   CSA (mm ²⁾ = masa (mg) / [(L _o mm) * (L / L _o) * (1,06 mg / mm ^3)],
   donde L / L _o es el cociente del músculo de fibra a la longitud (0,45 para EDL, 1,0 para el diafragma) ⁵ y 1,06 es la densidad del músculo.

Resultados

Los valores esperados para las fuerzas isométricas de músculos EDL de 12 semanas de edad los animales se muestran en la figura 1. Dado que los músculos mdx exponer hipertrofia compensatoria, la fuerza tetánica total puede ser mayor en los músculos mdx en comparación con controles emparejados por edad de tipo salvaje. Sin embargo, una medida más apropiada de la salida funcional es la fuerza específica (Figura 2), donde la fuerza se normaliza para el área transversal para calcular este valor. Fuerza específica depende de la capacidad inherente funcional del músculo, donde la debilidad en los músculos distróficos es más evidente cuando tanto la fuerza absoluta y área de sección transversal se tienen en cuenta. En nuestras manos, músculos EDL de ratones mdx generan aproximadamente 20 a 25% más bajas que las fuerzas específicas de la misma edad ratones de tipo salvaje 10 a 26 semanas de edad.

Para que el diafragma, solamente la fuerza específica es pertinente para las comparaciones porque la preparación es una pieza del músculo dependiente de la dissección. Comparación de la fuerza específica entre wildtype y músculos mdx diafragma refleja la patología progresiva en este tejido. Producción de fuerza isométrica disminuye con la edad (Figura 3), de modo que a los 6 meses de edad, los músculos del diafragma de ratones mdx no producen más de la mitad de la salida funcional de las tiras de membrana de edad con ajuste los controles de tipo salvaje.

Un ejemplo de las contracciones excéntricas de las pruebas de diafragma se muestra en la Figura 4. Con cada contracción excéntrica posterior, disminuye la producción de fuerza en las tiras de membrana, tanto de tipo salvaje (C57) y ratones mdx. Sin embargo, la pérdida de la fuerza es más dramático en muestras de músculo de ratón mdx, presumiblemente a partir de la ausencia de distrofina y sus proteínas asociadas.

Figura 1. Fuerza isométrica tetánica en wildtype y EDL músculos mdx f Rm 12 semanas de edad ratones. Fuerza absoluta puede ser mayor en la misma edad mdx músculos EDL debido a la hipertrofia compensatoria.

Figura 2. Isométrica fuerza tetánica normalizado por área de sección transversal del músculo es la fuerza específica, y revela la capacidad deprimido funcional de los músculos EDL de ratones mdx, en comparación con los de los ratones de tipo salvaje. Las huellas son de los mismos ratones como en la figura 1.

Figura 3. La pérdida progresiva de la capacidad de generación de fuerza evaluada por la fuerza específica es más evidente en el diafragma de ratones mdx (barras rojas) en comparación con los de tipo salvaje (C57 en línea azul).

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Figura 4. La pérdida de la fuerza como una función del número contracción excéntrica de los músculos del diafragma de 12 semanas de edad C57 y ratones mdx. Los datos son la media ± SEM para N = 4 músculos por genotipo.

Discusión

El objetivo de este artículo es proporcionar una guía para la realización de la función del músculo aislado en dos músculos de los ratones - la EDL y el diafragma. La evaluación de estos músculos puede dar una idea de si es o no candidatos terapéuticos para enfermedades musculares son beneficiosas. Para ambos músculos, el factor más importante en la obtención de datos fiables es una disección limpia. Por lo tanto, la práctica y el perfeccionamiento de la etapa de aislamiento inicial es esencial antes de pasar a las pruebas funcionales. Además, el establecimiento de parámetros funcionales para el músculo normal es crítico antes de hacer comparaciones con el músculo distrófico, o entre los tratamientos. Esto asegurará que los resultados del estudio no están sujetos a la alta variabilidad impartida por la capacidad de la persona que realiza los experimentos. El uso de un colorante impermeant membrana puede ayudar con la optimización de la preparación de la disección, para la incubación de cualquier músculo en una solución que contiene un colorante marcará fibras dañadas, y puede servir como un índice de dissection éxito. Minimizar el número de fibras dañadas en el músculo ayudará a optimizar la medición. Las fibras dañadas por disección fluorescencia mucho más intensamente que los perjudicados por la contracción excéntrica, y por lo que si el tinte también se utiliza durante el proceso de la mecánica, se puede utilizar la intensidad de la tintura para distinguir entre los dos tipos de daños.

La disección de las tiras de membrana casi siempre tienen daño de la fibra, porque simplemente cortando a lo largo de la longitud de las fibras, algunos inevitablemente se destruyen. La absorción de colorante es fuerte en esas fibras dañadas, y estos normalmente se restringen a los bordes exteriores de la preparación. En promedio, se observa una banda de fibras dañadas que es ~ 3 fibras de ancho (~ 120 m) a cada lado de la tira de músculo. Si la banda dañado comprende más de 15% del músculo, a continuación, los datos se descartan. La preparación diafragma también tiene limitaciones en el tamaño óptimo de las medidas funcionales. Hemos encontrado que los trozos de diaphragm que son más anchas que 5 mm comienzan a plegarse sobre sí mismas, debido a que el lazo del tendón central es sólo en un punto. Esto se traduce en disminución de la fuerza específica en la preparación. También hemos encontrado que tiras más estrechas también tienen menor fuerza específica, que creemos que es porque el número de fibras dañadas durante la disección comprender una mayor proporción de la cantidad total de fibra. Por ejemplo, si 0,1 mm en cada lado está dañado, a continuación, que es 5% (2x0.1 mm / 4 mm tira) de la preparación de músculo que no contribuye a la fuerza, mientras que si la tira es solamente 1 mm, a continuación, 20 % de la preparación músculo está dañado. Así, tanto la anchura de la región dañada, así como el ancho de toda la preparación son factores importantes a controlar.

Las mediciones de la tensión isométrica máxima requieren que todas las fibras musculares de un músculo se estimula. Debido a que hay una gran variabilidad en los componentes de un aparato de función, esto debe ser determinado para cada conjunto individualarriba. Por ejemplo, el tamaño del baño o el tipo de estimulador puede afectar a la intensidad de la estimulación. Estimulación Twitch es una forma razonable de determinar las condiciones supramáximos estimulación. Una vez que se estableció para una configuración específica y músculo, puede ser utilizado para estudios posteriores.

En contraste, la longitud óptima de cualquier músculo dado necesita ser medida para cada preparación utilizando el proceso iterativo descrito anteriormente. Esto asegura que la superposición de filamentos gruesos y delgados es óptima y la máxima capacidad potencial de generación de la fuerza se mide. Procedimientos alternativos pueden confiar en los patrones de difracción asociados con las estrías musculares, pero esto requiere un equipo adicional que no se describe aquí.

Habitualmente usamos 500 ms duración de la estimulación, se clasifica en el rango medio de este parámetro utilizado por otros investigadores en este campo. Aunque esto podría producir cierta fatiga del músculo durante la contracción, lo cual es evidentepor un "hundimiento" de la producción de fuerza máxima, esto en sí mismo puede ser informativa. Por ejemplo, una diferencia en la fatiga podría lograrse mediante diferentes tipos de terapias incluyendo aquellos manipulación de destino que el calcio, por lo tanto, el pandeo en vigor durante la contracción activa puede servir como un índice para la mejora. Alternativamente, la pérdida de la fuerza podría indicar que las suturas en los tendones no están suficientemente apretados, y que se deslice durante la contracción. El músculo se debe quitar de la bañera y las suturas deben ser re-atado si esto ocurre. También utilizamos una serie de 3 contracciones tetánicas, lo que ayuda a evaluar la estabilidad de la preparación. Una vez más, se desliza de sutura daría lugar a la pérdida de fuerza entre las contracciones, lo que requiere sutura re-vinculación. Músculos grandes también pueden generar núcleos de anoxia, que conducen a la pérdida de fuerza durante el protocolo. Tamaño muscular es un factor limitante para la realización de las pruebas de función muscular aislado, donde los músculos EDL con masas superiores a 20 mg perder fuerza con cada contracciónción, y no puede ser soportado por superfusión en un baño. Tiras de membrana no sufren de las mismas complicaciones porque son lo suficientemente delgada como para tener viabilidad prolongada en el baño.

Otros músculos puede ser utilizado para la función muscular aislado, incluyendo el músculo sóleo, que se utiliza comúnmente, pero no se describe aquí. Muchos de los mismos procedimientos que se pueden adoptar para el sóleo en términos de la preparación y la prueba de funcionamiento. Sin embargo, las diferencias principales están en la frecuencia de estimulación, y los parámetros para las contracciones excéntricas. El uso de los sóleo para la función complementaria de la de los otros dos músculos, y por lo que debe ser considerado como parte de un "paquete estándar" para la evaluación de ratones distróficos ^{4, 7.}

La contracción excéntrica proporciona un índice de fragilidad contráctil, y es importante utilizar un protocolo que resulta en la pérdida modesta de la fuerza en los músculos de los animales de tipo salvaje y una pérdida significativa de la fuerza enmúsculos distróficos no tratadas de modo que hay un amplio rango dinámico para las comparaciones. A falta de cualquier pérdida de fuerza en los músculos normales sugiere que la contracción excéntrica es demasiado suave, y no será adecuada para distinguir entre las terapias que no son eficaces y las que son realmente beneficiosos. Sin embargo, una dramática pérdida de fuerza en los músculos normales sometidos a la contracción excéntrica puede ser demasiado grande para desentrañar las diferencias asociadas con la enfermedad. Nuestro protocolo para la EDL y utiliza un diafragma 0,5 Lo / seg velocidad de estiramiento para producir un cambio de longitud del 10%. Por lo general realizar 5 contracciones excéntricas, que se traducen en una pequeña pérdida de fuerza en los músculos normales y una importante pérdida de fuerza en los músculos distróficos. Ciertamente, todos estos parámetros se pueden variar para aumentar el cambio de longitud total, la velocidad de estiramiento, o el número de contracciones excéntricas con el fin de distinguir las diferencias entre músculo enfermo y sano, así como sobre los efectos de un tipo específico de mutación o tratamiento que se está estudiando. Mientras haya una marcada diferencia entre los músculos normales y enfermos, entonces hay un estándar de oro para alcanzar en términos de tratamientos.

En resumen, este protocolo establece las directrices para la realización de contracciones isométricas y excéntrico, y espero que identifica los peligros potenciales para evitar al establecer esta técnica en su laboratorio.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo / material	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
sistema in vitro Prueba muscular	Aurora Científico	1200A
Microscopio de disección	Leica	MZ6
ACE fuente de luz	Schott-Fostec	A20500
Tijeras de disección	Herramientas Artes Ciencias	14060-11
Ángulo tijeras de disección	Herramientas Artes Ciencias	15006-09
Mango de bisturí	Herramientas Artes Ciencias	10003-12	herramienta alternativa de disección
Curved las hojas de bisturí # 12	Ciencia FineInstrumentos	10012-00	herramienta alternativa de disección
Tijeras de hueso	Herramientas Artes Ciencias	16044-10
S & T sutura empate fórceps	Herramientas Artes Ciencias	00272-13
Dumont SS forceps - ángulo	Herramientas Artes Ciencias	11203-25
Seda trenzada tamaño de la sutura 6-0	Teleflex Medical	07/30/10
Cinta médica	Transpore	3M
La ketamina clorhidrato 100 mg / ml	Hospira	NDC 0409-2051-05	Dosis final es de 80 mg / kg
Inyección TranquiVed (xilazina 100 mg / ml)	Vedco	NDC 50989-234-11	Dosis final es de 10 mg / kg
Reactive Orange 14	Sigma-Aldrich	R-8254
Componentes de la solución de Ringer			La solución es gas equilibrada con 95% de O 2 y 5% de CO 2, pH final 7,4
De cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S7653	Concentración final: 118 mM
El cloruro de potasio	Fisher Scientific	P217-3	Concentración final: 4,7 mM
Cloruro de calcio dihidrato	Fisher Scientific	C79-500	Concentración final: 2,5 mM
Fosfato de potasio monobásico	Fisher Scientific	P-285	Concentración final: 1,2 mM
Sulfato de magnesio	JT Baker	2500-01	Concentración final: 0,57 mM
4 - (2-hidroxietil) pipeRazine-1-etanosulfónico (HEPES)	Fisher Scientific	BP310-500	Concentración final: 5,95 g / L
Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270	Concentración final: 5,5 mM