En este protocolo, demostramos la fabricación de sustratos biomiméticos de cultivo de células cardíacas hechos de dos materiales poliméricos distintos utilizando litografía de fuerza capilar. Los métodos descritos proporcionan una técnica escalable y rentable para diseñar la estructura y función de los tejidos cardíacos macroscópicos para aplicaciones in vitro e in vivo.
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Artículo de método
Capilar Fuerza Litografía Cardiaca de Ingeniería de Tejidos
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Resumen
Resumen
La enfermedad cardiovascular sigue siendo la causa principal de muerte en todo el mundo 1. Ingeniería de tejidos cardíacos es muy prometedora para entregar los descubrimientos médicos innovadores con los objetivos de desarrollo de tejidos funcionales para la regeneración cardiaca, así como ensayos de cribado in vitro. Sin embargo, la capacidad de crear modelos de alta fidelidad de tejido del corazón ha demostrado ser difícil. Matriz extracelular del corazón (ECM) es una estructura compleja que consta de dos señales bioquímicas y biomecánicas que van desde la micro-a la escala del nanómetro 2. Local condiciones de carga mecánica y las interacciones célula-ECM han sido recientemente reconocida como componentes vitales en la ingeniería de tejido cardíaco 3-5.
Una gran parte de la MEC cardiaca se compone de fibras de colágeno alineados con diámetros de nano-escala que influye significativamente en la arquitectura del tejido y el acoplamiento electromecánico 2. Por desgracia, algunos métodos VHAe sido capaz de imitar la organización de las fibras de ECM a la escala nanométrica. Los recientes avances en las técnicas de nanofabricación, sin embargo, han permitido el diseño y la fabricación de andamios escalables que imitan las señales in vivo de rigidez estructural y del sustrato en del ECM en el corazón de 6-9.
Aquí se presenta el desarrollo de dos reproducible, procesos nanoestampación escalables para la alineación funcional de las células cardiacas utilizando el poli biocompatible de polímero (láctico-co-glicólico) (PLGA) 8 y una de poliuretano (PU) de polímero a base rentable y. Estos sustratos anisotrópicamente nanofabricados (ANF) imitan el ECM subyacente de tejidos, alineados bien organizadas y se puede utilizar para investigar el papel de nanotopografía sobre la morfología celular y la función 10-14.
El uso de un nanoestructurada (NP) maestro de silicio como una plantilla, un acrilato de poliuretano (PUA) de molde se fabrica. Este molde PUA se utiliza entonces para PAttern hidrogel PU o PLGA mediante UV-asistida o fuerza capilar litografía-solvente mediada (CFL), respectivamente 15,16. Brevemente, PU o PLGA de pre-polímero es gota dispensado sobre un cubreobjetos de vidrio y el molde PUA se coloca en la parte superior. Para CFL UV asistida, la PU se expone entonces a la radiación UV (λ = 250-400 nm) para el curado. Para disolvente mediada CFL, el PLGA se graba en relieve el uso de calor (120 ° C) y presión (100 kPa). Después del curado, el molde PUA se despega, dejando atrás un ANF para el cultivo celular. Las células primarias, como los miocitos ventriculares de rata neonatal, así como los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes humanas, se pueden mantener en la ANF 2.
Introducción
La enfermedad cardiovascular es la principal causa de morbilidad y mortalidad en el mundo y presenta una carga socioeconómica de peso en un 1,17 sistema mundial de salud ya tensas. Ingeniería de tejidos cardíacos tiene dos objetivos distintos: (1) para regenerar el miocardio dañado después de la enfermedad isquémica o miocardiopatía o (2) para crear un modelo de alta fidelidad del corazón para la detección in vitro de drogas o la modelización de enfermedades.
El corazón es un órgano complejo que se debe trabajar constantemente para suministrar sangre al cuerpo. Estructuras laminares densamente poblado de cardiomiocitos....
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Protocolo
Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente (~ 23 ° C) a menos que se indique lo contrario.
1. Fabricación de Silicon Maestro
- Limpio oblea de silicio con etanol al 100% o xileno y se seca a O 2 / N 2 de gas.
- Coloque oblea de silicio en Spin-revestidor a velocidades de rotación de 2.000-4.000 rpm para producir una película de espesor de 0,3-0,5 micras.
- Patrón de la película fotorresistente con las dimensiones correctas mediante el uso de un sistema de fotolitografía
- Sumergir completamente las obleas de silicio fotorresistentes recubiertos con dibujos en un vol....
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Resultados
La figura 1 es una vista general esquemática del proceso de producción para los dos métodos de fabricación. Debido a la difracción de la luz causada por la topografía a escala nanométrica, nanoestampación debe resultar en una superficie iridiscente a la ANF. Figura 2 representa esta superficie iridiscente en un 25 mm NP-PU cubreobjetos bien modelada (Figura 2A) con cresta 800 nm y la ranura ancho (Figura 2B). El aspecto iridiscente de la ANF variará lig.......
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Discusión
Tejidos cardíacos Funcionalmente maduros carecen de tanto in vivo como in vitro en aplicaciones de ingeniería de tejido cardíaco. Los métodos de nanofabricación CFL descritos aquí son técnicas robustas para lograr la alineación celular e influir en la función del tejido macroscópico debido a la escalabilidad del sistema. Grandes áreas pueden ser fácilmente modelados y se utilizan para el cultivo de células. Alineación celular macroscópico es esencial en la ingeniería de tejido cardiaco con el fin de crear biomi.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
D. H. Kim agradece al Departamento de Bioingeniería de la Universidad de Washington por el nuevo fondo inicial para el profesorado. D. H. Kim también cuenta con el apoyo del Premio Perkins Coie al Descubrimiento, el Premio de la Asociación de Investigación Traslacional de la Fundación Wallace H. Coulter, el Fondo de Descubrimiento de Ciencias de la Vida del Estado de Washington y la Subvención de Desarrollo Científico de la Asociación Americana del Corazón (13SDG14560076). J. Macadangdang y A. Jiao agradecen el apoyo de los NIH Bioengineering Beca de Capacitación Cardiovascular. El apoyo adicional para este trabajo proviene de la subvención de los Institutos Nacionale....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fibronectina | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Promotor de adherencia de superficies (imprimación de vidrio) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Rodillo de caucho blando | Obleas | ||
| NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | ||
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Revelador Photoresist | Shipley | MF320 | |
| Sistema de litografía por haz de electrones | JEOL | JBX-9300FS Sistema de | |
| grabado | Sistemas de tecnología de superficie | NP10 8UJ | |
| Sistema de plasma Asher BMR | Technology Co. | DSF-200 | |
| Sistema de curado con ozono | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Sistema de curado por fusión | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Recubrimiento giratorio | Tecnología de laurel | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| Portaobjetos de vidrio de 25 mm | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poli(D,L-lactida-co-glicólido) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Cloroformo | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500 g Pesos | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Alcohol isopropílico | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Placa caliente | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson B2510MTH |
Referencias
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
- Kim, D. -H., et al.
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Reimpresiones y permisos
