Una sola molécula de imágenes del Reglamento Gene En vivo Utilización de la activación cotraduccional por escisión (COTRAC)

Resumen

Se describe un método de microscopía de fluorescencia, co-translacional de activación por escisión (COTRAC), a la imagen de la producción de moléculas de proteína en células vivas con precisión una sola molécula sin perturbar la funcionalidad de la proteína. Este método se ha utilizado para seguir la dinámica de expresión estocásticos de un factor de transcripción, el λ represor CI ¹.

Resumen

Se describe un método de microscopía de fluorescencia, co-translacional de activación por escisión (COTRAC) a la imagen de la producción de moléculas de proteína en células vivas con precisión una sola molécula sin perturbar la funcionalidad de la proteína. Este método hace posible contar el número de moléculas de proteína producida en una célula durante las ventanas secuenciales, el tiempo de cinco minutos. Se requiere un microscopio de fluorescencia con una densidad de potencia del láser de excitación de ~ 0,5 a 1 kW / cm ^2, que es suficientemente sensible para detectar moléculas individuales de proteínas fluorescentes en células vivas. El reportero fluorescente usada en este método se compone de tres partes: una secuencia de dirección de membrana, una maduración rápida, proteína fluorescente amarilla y una secuencia de reconocimiento de proteasa. El reportero está fusionado traduccionalmente al extremo N-terminal de una proteína de interés. Las células se cultivan en una platina de microscopio de temperatura controlada. Cada cinco minutos, moléculas fluorescentes dentro de las células se crean imágenes (y más tarde coUnted mediante el análisis de imágenes de fluorescencia) y posteriormente photobleached modo que las proteínas recién traducido sólo se cuentan en la siguiente medición.

Imágenes de fluorescencia resultante de este método se puede analizar mediante la detección de manchas fluorescentes en cada imagen, asignándolos a las células individuales y luego asignar células a linajes celulares. El número de proteínas producidas dentro de una ventana de tiempo en una célula dada se calcula dividiendo la intensidad integrada de fluorescencia de las manchas por la intensidad media de las moléculas fluorescentes individuales. Se utilizó este método para medir los niveles de expresión en el intervalo de 0-45 moléculas individuales en 5 min ventanas de tiempo. Este método nos permitió medir el ruido en la expresión del represor CI λ, y tiene otras muchas aplicaciones potenciales en la biología de sistemas.

Protocolo

1. Strain Engineering Workflow

1. Inserto que codifica secuencias de (a) una secuencia de localización de membrana, (b) una proteína fluorescente de maduración rápida y (c) una secuencia de reconocimiento de la proteasa N-terminal a y en marco con una proteína de interés (por ejemplo, un factor de transcripción). Se utilizó la membrana dirigida TSR-Venus reportero ² y fusionado a la secuencia de reconocimiento de la proteasa ubiquitina (Ub) para contar el número de expresadas bacteriófago λ represor CI moléculas de proteína. Los detalles sobre cómo se construyó la proteína de fusión TSR-Venus-Ub-CI, en sustitución de la de tipo salvaje CI región de codificación y la incorporación del constructo en la E. coli cromosoma utilizando λ recombinación Red ^3, se describen en detalle en la ref. 1.
2. Verifique que todas las modificaciones de la secuencia.
3. Transformar un plásmido que codifica una proteasa específica para la secuencia de reconocimiento utilizado anteriormente en una cepa que expresa el indicador fluorescente y proteína de interésen fusión traduccional. Se utilizó la proteasa UBP1, que escinde inmediatamente después de que el residuo C-terminal de ubiquitina ^4.

2. Las células de cultivo y preparar la Muestra

1. Elija una E. colonia coli de interés a partir de una placa de agar recién rayada en 1 ml mínimo M9 suplementado con ⁵ medios 1X MEM aminoácidos ácidos y los antibióticos apropiados. Incubar en un agitador a temperatura deseada lo suficientemente largo para llegar a OD _600> 1,0 (densidad óptica a 600 nm).
2. Se diluye la cultura en 1 ml de medio fresco M9 con los antibióticos apropiados a OD ₆₀₀ = 0,02. Incubar en un agitador a temperatura apropiada. Densidad celular inicial se puede aumentar si es necesario para el crecimiento a baja temperatura.
3. Cuando la DO ₆₀₀ = 0,2-0,3 (a 37 ° C con un cultivo de células inicial a una DO ₆₀₀ = 0,02, esto llevará hr 3-4), comenzar a preparar el gel de agarosa almohadilla (paso 3).
4. Las células están listas para la formación de imágenes cuando OD _{600 = 0.3-0.4.}
5. Se transfiere 1 ml de cultivo se incubaron en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, centrifugar a 10.000 xg durante 1 min en una microcentrífuga de sobremesa.
6. Desechar el sobrenadante y añadir 1 ml de medio fresco M9 y resuspender el pellet suavemente.
7. Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min.
8. Repita los pasos 1,6 y 1,7. Eliminar el sobrenadante.
9. Suavemente resuspender en 1 ml de medio M9. Las células se pueden usar directamente para imágenes de microscopio o diluida 10 - a 100-veces para asegurar bajas densidades celulares para formación de imágenes timelapse. Tenga en cuenta que las bajas densidades celulares son importantes para la formación de imágenes timelapse extendida. La cámara de formación de imágenes (paso 4) se sella durante el experimento. Debido al crecimiento exponencial de las células, las altas concentraciones de células iniciales puede reducir significativamente el oxígeno dentro de la cámara después de un crecimiento prolongado en la almohadilla de gel, reduciendo la maduración de la proteína fluorescente y afectando el crecimiento celular.

3. Preparar la solución de agarosa

1. Pesar 10-20 mgbaja temperatura de fusión de agarosa en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Añadir un volumen apropiado medio mínimo M9 sin antibióticos para hacer una solución al 3% de agarosa.
3. Se calienta la solución de agarosa durante 30 min a 70 º C para fundir, invirtiendo el tubo para asegurar que la solución está completamente fundida y homogénea. La almohadilla de gel se puede verter en este punto (paso 4) o la temperatura puede disminuirse a 50 ° C y se mantuvo durante varias horas para su uso posterior.

4. Preparar Pad Gel en la Cámara

1. Cerca de 50 minutos antes de la proyección de imagen, una diapositiva Microaqueduct enjuague con agua.
2. Enjuagarse limpiar vidrio de cubierta (usando un método de limpieza rigurosas tal como el descrito en ⁶⁾ y Microaqueduct portaobjetos con agua estéril y se seca por soplado con aire comprimido.
3. Coloque la junta de goma en la diapositiva Microaqueduct de modo que cubra las entradas y salidas en el lado del cristal de la corredera Microaqueduct (esto se puede modificar para aplicaciones enmedios de comunicación que se perfunde a través de la muestra). Aplicar 50 l solución de agarosa (paso 3) para el centro de la diapositiva Microaqueduct.
4. Arriba la solución de agarosa con el limpiado, vidrio de cubierta seca.
5. Dejar que la solución de agarosa en reposo a temperatura ambiente durante 30 min.
6. Mientras tanto, preparar una muestra de células (paso 2).
7. Despegue cuidadosamente el vidrio de cubierta de la parte superior de la almohadilla de gel. Añadir 1,0 l cultivo de células lavadas a la parte superior de la almohadilla de gel. Esperar a ~ 2 min para el cultivo a ser absorbido por la almohadilla de gel. Es importante no esperar tanto tiempo que los overdries almohadilla de gel, pero lo suficientemente largo que las células están correctamente adherida a la almohadilla de gel. El tiempo de espera Ideal variará con la temperatura y la humedad.
8. Mientras espera, secar otra cubierta de vidrio lavadas.
9. Cubrir la muestra con la cubierta de vidrio nuevo asegurándose de que la cubierta de vidrio deslizante y Microaqueduct están bien alineados.
10. Montar la cámara de temperatura controlada crecimiento siguiendo las instrucciones del fabricante.Se puede utilizar ahora para formación de imágenes en microscopio (paso 5).

5. Imagen y Adquisición de Películas Timelapse

1. Encender el láser y microscopio siguiendo las instrucciones del fabricante (por ejemplo, el láser puede ser necesario calentar durante ~ 0,5 h antes del experimento).
2. Bloqueo de la cámara montada en el inserto de etapa en el microscopio. Establecer la temperatura de la cámara de crecimiento y el calentador objetivo a 37 º C o de otra temperatura deseada crecimiento.
3. Si obtención de imágenes por encima de la temperatura ambiente, el enfoque o la almohadilla de gel normalmente se reduciría significativamente durante ~ 15 min después del cambio de temperatura inicial. En la práctica, utilizar este tiempo para encontrar las regiones de interés y modificar los scripts de imagen según sea necesario para un experimento.
4. Encontrar las células en el microscopio y almacenar la posición de cada célula después de centrado dentro de una región de formación de imágenes predefinida y alineado. Más de una celda puede ser reflejada en cada ventana de tiempo de adquisición de imagen. Para timelapse imágenes sobre mlas generaciones, asegurar que las células con imagen son inicialmente separadas de otras células por lo menos unos pocos cientos de micras de modo que otras colonias no entrará en la región de formación de imágenes durante el crecimiento.
5. Ajuste de la intensidad del láser de excitación para que casi todas las moléculas fotoblanqueador fluorescente dentro de 6 exposiciones (Figura 5).
6. Utilización de un script automatizado de imágenes / revista, adquirir datos timelapse utilizando el algoritmo descrito en el flujo de trabajo experimental en la figura 3.

Resultados

Los resultados típicos de un experimento de COTRAC seguimiento de la producción de la CI λ represor se muestran en las Figuras 4 y 5. En este experimento, 12 colonias fueron imágenes a intervalos de 5 min. En cada punto de tiempo, la colonia se autofocused primera y centralizada dentro de la región de formación de imágenes. A continuación, la posición centrada / focalizada y se almacenó una imagen de campo claro fue adquirida. La etapa se transloca luego por ~ 0,5 micras a lo largo del ...

Discusión

El método COTRAC puede ser generalizado para medir la producción de otras proteínas en la que N-o C-terminales convencionales fusiones de proteínas fluorescentes pueden perturbar la actividad de proteína. La estrategia COTRAC tiene tres ventajas únicas sobre los métodos actuales. En primer lugar, co-traduccional de fusión asegura que una molécula del indicador fluorescente es producida por cada molécula de la proteína de interés, lo que permite un recuento preciso de la producción de proteínas en tiempo real. En segundo...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Agarosa (baja temperatura de fusión)	Lonza	50100
Milli-Q H 2 O
5 × sales M9			Siguiente receta descrita en 9
20% de glucosa
MgSO 4
CaCl 2
50 × solución de aminoácidos MEM	Invitrogen	11130-051
Temperatura Controlada por el crecimientoCámara Etapa adaptador	Bioptechs	FCS-2
Calentador Objetivo	Bioptechs	Modelo depende objetivo de microscopio
Microaqueduct Slide	Bioptechs	130119-5
Lentes Micro cubierta	VWR	40CIR-1	Puede ser difícil de fuente, también disponible a partir de Bioptechs
Tapa de cristal corredizo / junta	Bioptechs	FCS2 0,75 mm
Microscopio de Fluorescencia	Vario	Ejemplo de configuración: Coherente Innova 308C-ion argón láser, Olympus IX-81 microscopio Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objetivo, Metamorph software	Debe tener una excitación láser, etapa automatizado xyz, software de automatización capaz de obtener imágenes con guión y autofocus, óptica capaces de resolvinag fluorescentes proteínas individuales
EM-CCD cámara	Vario	Ejemplo de configuración: Andor Ixon DU-898	Debe tener ruido suficientemente bajo como para detectar las proteínas fluorescentes individuales por encima de fondo