El ensayo cometa es una manera eficaz de detectar saltos de simple y doble hebra, incluyendo álcali-lábiles y sitios DNA-DNA/DNA-protein enlaces cruzados en el ADN en todas las células incluyendo neuronas del hipocampo. El método se aprovecha de la migración diferencial de ADN en un campo eléctrico debido a las diferencias en la cantidad de daño en el DNA.
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Artículo de método
Ensayo de daño del ADN en las neuronas del hipocampo utilizando el ensayo cometa
En este artículo
Resumen
Resumen
Un número de medicamentos se dirigen las rutas de reparación de ADN e inducir la muerte celular mediante la creación de daños en el ADN. Así, los procesos para medir directamente el daño del ADN han sido ampliamente evaluados. Los métodos tradicionales requieren mucho tiempo, los recursos costosos, y requieren células en replicación. En contraste, el ensayo de cometa, un gel de una sola célula del ensayo de electroforesis, es más rápido, no invasivo, de bajo costo medida, directa y sensible de daño y reparación del ADN. Todas las formas de daño en el ADN, así como la reparación del ADN puede ser visualizado en el nivel de células individuales utilizando esta técnica de gran alcance.
El principio que subyace a la prueba del cometa es que el ADN intacto es muy ordenado, mientras que el daño del ADN altera esta organización. Las filtraciones de ADN dañado en la matriz de agarosa y cuando se somete a un campo eléctrico, el ADN cargado negativamente migra hacia el cátodo, que está cargado positivamente. Las hebras grandes no dañadas de ADN no son capaces de migrar lejos del núcleo. Daño en el DNAcrea pequeños fragmentos de ADN, que pueden desplazarse más lejos que el ADN intacto. Comet Assay, un software de análisis de imagen, y compara las medidas de la intensidad global fluorescente del ADN en el núcleo con ADN que ha migrado fuera del núcleo. Señal fluorescente del ADN migrado es proporcional al daño del ADN. Brillante cola más larga de ADN significa un mayor daño del ADN. Algunos de los parámetros que se miden son momento de la cola, que es una medida tanto de la cantidad de ADN y la distribución de ADN en la longitud de la cola de la cola, y el porcentaje de ADN en la cola. Este ensayo permite medir la reparación del ADN, así ya que la resolución de daños en el ADN significa reparación ha tenido lugar. El límite de sensibilidad es de aproximadamente 50 roturas de cadena por célula diploide 1,2 mamíferos. Las células tratadas con agentes que dañan el ADN, tales como etopósido, se puede utilizar como un control positivo. Así, el ensayo cometa es un procedimiento rápido y eficaz para medir el daño del ADN.
Protocolo
1. Cultivo celular
- Cultura células neuronales y tratarlos según sea necesario.
- Células cosecha en tubos de 15 ml: medios de aspirado, enjuague con tampón fosfato salino (PBS, calcio y magnesio libre), añadir tripsina, recoger en tubos de 15 ml y neutralizar la tripsina con apropiados medios que contienen suero.
- Girar a 1.000 xg durante 5 min.
- Aspirar medios de comunicación.
- Resuspender las células en PBS.
- Girar a 1.000 xg durante 5 min.
- Aspirar medio y las células se resuspenden en PBS fresco.
- Contar las células utilizando un hemocitómetro o su contador celular preferido.
- Las m....
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Discusión
El ensayo de cometa tiene la capacidad única de análisis de células individuales. Esto es ventajoso en la identificación de las subpoblaciones de células que muestran una respuesta diferencial a los agentes citotóxicos. A pocas limitaciones prácticas tienen que ser tomadas en cuenta. El número de células que pueden ser evaluados individualmente puede variar dependiendo de la persona. El tamaño de la muestra debe ser mayor si existe una variación en el daño del ADN dentro de una población. Viable sola célula de suspensió.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Impact Award del Departamento de Oncología de Radiación de la Universidad de Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, la Fundación de Niños con Cáncer de lucha, y el Ángel de Gabrielle Foundation (para ESY.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | El número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| 1,5 ml tubos | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, ácido bórico, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tubo | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarosa | Sigma | A5093 | |
| Lámina de aluminio | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Vaso | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrífugo | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Ensayo Cometa software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cilindro | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electroforesis cámara | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Etanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Microscopio de fluorescencia | Zeiss Axio Vision | Cualquier microscopio de fluorescencia con filtro verde será suficiente | |
| Hemocitómetro | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Bajo punto de fusión de agarosa | Promega | V2111 | |
| Microonda | Sears | ||
| Tampón fosfato salino, calcio magnesio libre, libre | HyClone | SH3025601 | |
| Fuente de alimentación | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerador | Sears | ||
| Regla | Staples | ||
| Deslizar | Fisher Scientific | 12550143 | |
| De cloruro de sodio | Sigma | S7653 | |
| Hidróxido de sodio | Sigma | S5881 | |
| Sodio lauril sarcosinato | Fisher Scientific | S529 | |
| SYBR Green | Invitrogen | S7585 | |
| Bandeja | Fisla Ciencia | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tripsina | HyClone | SH3023601 | |
| Vórtice | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Baño de agua | Fisher Scientific | 154622Q |
Referencias
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleu....
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Reimpresiones y permisos
