Cuantificación de la permeabilidad glomerular de macromoléculas fluorescentes mediante microscopía 2-Photon en Munich Ratas Wistar

Summary

Una técnica de la utilización de alta resolución intavital 2 fotones microscopía de visualizar directamente y cuantificar la filtración gloemrular en los glomérulos superficie. Este método permite la determinación directa de las características de permeabilidad de macromoléculas tanto en estados normales y enfermos.

Abstract

Enfermedades renales que implican la pérdida urinaria de grandes macromoléculas esenciales, tales como albúmina de suero, durante mucho tiempo han sido pensado para ser causada por alteraciones en la barrera de permeabilidad compuesta de podocitos, células endoteliales vasculares, y una membrana basal de trabajo al unísono. Los datos de nuestro laboratorio utilizando microscopía intravital 2 fotones revelaron una barrera más permeable filtración glomerular (GFB) que se creía en condiciones fisiológicas, con la recuperación de la albúmina filtrada que ocurre en un subconjunto inicial de células llamadas células de los túbulos proximales (PTC) ^{1,2, 3.}

Las técnicas anteriores han usado para estudiar la filtración renal y el establecimiento de la característica de la barrera de filtración involucrados micropunción del lumen de estos primeros segmentos tubulares con el muestreo de los contenidos y el análisis de fluido ^4. Estos estudios determinaron la concentración de albúmina en el fluido luminal de ser prácticamente inexistente; corresponde estrechamentea lo que se detecta normalmente en la orina. Sin embargo, la caracterización de los polímeros de dextrano con tamaños definidos por esta técnica reveló los de un tamaño similar a la albúmina sérica tenían niveles más altos en el lumen tubular y la orina, sugiriendo aumento de la permeabilidad ^5.

En esto es un esquema detallado de la técnica utilizada para visualizar y cuantificar directamente glomerular fluorescente permeabilidad a la albúmina in vivo. Este método permite la detección de la albúmina filtrada a través de la barrera de filtración en el espacio de Bowman (la cámara inicial de la filtración urinaria), y también permite la cuantificación de la albúmina por la reabsorción de los túbulos proximales y la visualización posterior de transcitosis albúmina ^6. La ausencia de albúmina fluorescente a lo largo de los segmentos tubulares posteriores en la ruta a la vejiga pone de relieve la eficacia de la vía de recuperación en los segmentos proximales antes del túbulo. Por otra parte, cuando se aplica esta técnica para determinar la permeabilidadSe informó de dextranos que tienen un tamaño similar a los valores de permeabilidad virtualmente idénticos albúmina ^2. Estas observaciones apoyan directamente la necesidad de ampliar el foco de muchas enfermedades renales proteinúricas a modificaciones incluidas en la recuperación de células del túbulo proximal.

Protocol

1. Conjugación de albúmina de suero de rata Sulfo-rodamina 101 cloruro de sulfonilo (Rojo Texas)

1. Disolver 100 mg de albúmina de suero de rata (RSA) en 6.667 ml de 100 mM de bicarbonato de sodio pH 9,0; concentración final 15 mg / ml en un tubo de 50 ml cónico.
2. Solución Colocar en hielo / agua vaso de precipitados y se enfría a entre 0 y 4 ° C.
3. Añadir 200 l de formamida dimetil alta calidad anhidra (DMF) a un vial de 10 mg de cloruro de sulfonilo Texas Red (TRSC); vórtice en el medio durante 15 segundos.
4. Solución RSA Vortex en medio y añadir el TRSC disuelto.
5. Resumen 50 ml cónica en papel de aluminio (Parafilm se pued....

Results

La Figura 3 muestra un ejemplo de una imagen tomada de una superficie de un glomérulo Múnich Frömter rata Wistar y las medidas adoptadas para determinar la permeabilidad de la albúmina fluorescente. El valor GSC para la albúmina de 0.0111 deriva de este otoño glomérulo individual dentro del rango observado en esta cepa de ratas Wistar Munich cuando en el estado alimentado ^3. La estabilidad se ve en estas imágenes es debido a la planificación y ejecución de las instrucciones representadas en <.......

Discussion

Los pasos que destacamos a continuación representan lo que sentimos al ser los que van a producir los valores de permeabilidad consistentes y precisos, ya que eludir las trampas siguientes:

1. Dispersión: El uso de un rojo fluoróforos que emiten permite una mayor eficiencia recaudatoria de la luz ya que los fotones de longitud de onda más largas son menos propensos a la dispersión. Utilizando cualquiera de fluoróforos que emiten verde o azul introducirá una mayor variación en el GSC de debido a la mayor variab.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio confocal/multifotónico Olympus Floview 1000	Olympus America		Filtros para detectores: Azul 430/100, Verde 525/50, Rojo 605/90
Modo bloqueado Ti:Zafiro Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Longitudes de onda de excitación sintonizables: ~750-1150 nm
Fotodetectores de fosfuro de arseniuro de galio	Hamamatsu Corp		Nota: Configuraciones de montaje frontal o lateral disponibles.
Metamorph Software de procesamiento de imágenes	Dinámica Molecular		Nota: Versión 6.1r1
Microsoft	Excel Microsoft Corportation		versión 2007
Manejo de pinzas	Ciencias de Microscopía Electrónica	Cat# 78266-04
Tijeras de disección Mayo	Ciencias de Microscopía Electrónica	Cat# 72962
CA Micro tijeras Modelo 1C300	Ciencias de la Microscopía Electrónica	Cat# 78180-1C3
Pinzas Hemostáticas Kelly (rectas)	Ciencias de la Microscopía Electrónica	Cat# 72930
Manta de chaqueta de agua + almohadilla térmica	Gaymar		T/Bomba PN 11184-000 Manta-66N111CC
Repti-Therm Calentador	ZooMed		RH-4
Texas Cloruro de sulfonilo rojo	Invitrogen/Sondas moleculares	Cat# T-353
Albúmina de suero para ratas	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
DMF anhidro de alta calidad	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Cinta de autoclave Strate-Line	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Platos de fondo (50 mm/40 mm coverslip)	Ciencias de la Microscopía Electrónica Cat	# 70665-07