Diluido-skull técnica de ventana cortical para En Vivo Tomografía de Coherencia Óptica de imagen

Resumen

Se presenta un método de creación de una ventana adelgazada cráneo cortical (TSCW) en un modelo de ratón para In vivo Imágenes de OCT de la corteza cerebral.

Resumen

Tomografía de Coherencia Óptica (OCT) es una técnica de imagen biomédica con alta resolución espacial y temporal. Con su enfoque mínimamente invasivo octubre se ha utilizado ampliamente en oftalmología, dermatología, gastroenterología y ^1-3. Usando una ventana adelgazado-skull cortical (TSCW), empleamos dominio espectral OCT (SD-OCT) modalidad como una herramienta para la imagen de la corteza en vivo. Comúnmente, un cráneo abierto-se ha utilizado para neuroimagen, ya que proporciona más versatilidad, sin embargo, un enfoque TSCW es menos invasiva y es un medio eficaz para la formación de imágenes a largo plazo en los estudios de neuropatología. Aquí, se presenta un método de creación de un TSCW en un modelo de ratón para la formación de imágenes in vivo octubre de la corteza cerebral.

Introducción

Desde su introducción en la década de 1990, octubre se ha utilizado ampliamente para formación de imágenes biológicas de la estructura tisular y la función ^2. Octubre genera imágenes transversales mediante la medición de retardo del eco de tiempo de ⁴ luz dispersada por la aplicación de fuente bajo la luz coherencia con un interferómetro de Michelson fibra óptica ^2,4. SD-OCT, también conocido como dominio de Fourier OCT (OCT-DF), fue introducido por primera vez en 1995 ^5, y ofrece una modalidad de imagen superior en comparación con el tradicional dominio de tiempo OCT (OCT-DT). En SD-octubre, el brazo de referencia se mantiene estacionaria que resulta en una velocidad alta y ultra adquisición de imagen de alta resolución ^6-9.

Actualmente, los modelos TSCW se han utilizado en gran medida para aplicaciones in vivo de imágenes del cerebro de dos fotones microscopía en lugar de una craneotomía tradicional. Estos TSCW se han utilizado conjuntamente con una placa de cráneo personalizado o un cubreobjetos de vidrio ^10-13 para proporcionar adicional imaging estabilidad. En nuestros estudios, hemos observado que los accesorios de este tipo no son necesarios para octubre de imagen cuando se utiliza un TSCW. Por lo tanto, la falta de una placa de cráneo o cubierta de vidrio se desliza permite una gama más amplia de tamaño de imagen de la ventana ya que pueden interferir con el haz óptico y modificar las imágenes octubre

Una preparación adelgazada cráneo ha demostrado ser ventajosa en los estudios de imágenes del cerebro usando microscopía de dos fotones ^10-13. En nuestros experimentos, utilizamos un sistema SD-OCT para la imagen de la corteza en vivo a través de un TSCW. Nuestra costumbre SD-OCT configuración de imagen contiene una banda ancha, de baja coherencia fuente de luz que consiste en dos diodos superluminiscente (SLD) con centro en 1295 nm con un ancho de banda de 97 nm que resulta en una resolución axial y lateral de 8 micras y 20 micras, respectivamente ¹⁴ . Con nuestro dispositivo de formación de imágenes ópticas, prevemos que las imágenes a través de un TSCW tiene un gran potencial en la identificación y la visualización de las estructuras y funciones en la juntacerebro ptically denso tejido.

Protocolo

1. Preparación quirúrgica

1. Ratones hembra CD 1 entre las edades de 6-8 semanas se usaron en nuestros experimentos.
2. Se anestesia el ratón con una inyección intraperitoneal de una combinación de ketamina y xilazina (80 mg / kg ketamine/10 mg / kg de xilazina). Coloque el ratón sobre una almohadilla homeotérmico para garantizar una temperatura corporal óptima a ~ 37 ° C. Supervisar continuamente el nivel de anestesia por probar reflejos animal (por ejemplo, pellizcar pie con fórceps romos) e inyectar más anestesia cuando sea necesario.
3. Lubricar ambos ojos con un ungüento de lágrima artificial. Elimine los pelos en el cuero cabelludo con una navaja de afeitar y depilar residual usando 70% almohadillas con alcohol. Aplique una capa delgada de crema de depilación Nair sobre el cuero cabelludo y esperar 2 minutos para que haga efecto. Limpie suavemente el pelo Nair y restantes humedecido con solución salina hisopos de algodón y almohadillas de preparación con alcohol. Scalp ahora debe estar completamente sin pelo.
4. Desinfecte cuero cabelludo con un palo betadine hisopo y limpiar con 70% de etanol almohadillas de preparación.
5. Envuelva cuidadosamente el animal en paños quirúrgicos para garantizar una temperatura óptima del cuerpo de ~ 37 ° C y montar el animal en un marco estereotáxico para inmovilizar el cráneo. Golpee suavemente el cráneo para asegurar su estabilidad. Una lista de los materiales utilizados se proporcionan en la Tabla 1.

2. Diluido-skull Preparación ventana cortical

1. Inicie la incisión en el punto de la línea media entre los ojos. Continuar caudalmente hasta el punto de la línea media entre las orejas. Parte de la piel con pinzas.
2. Localizar el área a ser diluido con un microscopio de disección y se retire suavemente la fascia usando unas pinzas. Seque el cráneo con hisopos de algodón estériles antes de crear la ventana cortical adelgazada. En nuestros experimentos, hemos creado un 4 × 4 mm adelgazada ventana craneal ~ 1 mm posterior y lateral al bregma.
3. Comience el adelgazamiento de la calavera con una fresa redonda de carburo con el tamaño de la broca de 0,75 mm en un taladro quirúrgico utilizando sólo su luz movimiento de barridoy. No aplique presión directa en el cráneo. Deje de perforar cada segundo 20-30 para eliminar el polvo de hueso con solución salina estéril y torundas de algodón y evitar el sobrecalentamiento del cráneo. La solución salina también ayuda a disipar el calor por todo el cráneo.
4. Una vez que la capa exterior del hueso compacto se elimina por completo la capa media del hueso esponjoso debe ser visible. Puede haber un poco de sangrado como los vasos sanguíneos son más evidentes en la capa de hueso esponjoso. Cambie a una fresa de piedra verde y continuar perforando con mucho cuidado ya que la capa esponjosa es más delicado. La fresa de piedra verde se retire el material menos hueso al crear uniformidad en toda la ventana craneal. Detener la perforación de vez en cuando para quitar el polvo de hueso y para enfriar el cráneo.
5. Finalmente, cuando el cráneo se ha vuelto más transparente y la vasculatura del cerebro es ahora visible, empezar a pulir el cráneo con una fresa de pulido. Esto permitirá una más precisa adelgazamiento mientras alisar el cráneo. Compruebe delgadez de la skull golpeando suavemente sobre ella con fórceps. Deje de pulido cuando el cráneo se vuelve ligeramente flexible.
6. La ventana craneal adelgazado ahora debe ser completamente lisa y reflectante y listo para la formación de imágenes (Figura 1). Debido a la naturaleza de los tejidos altamente dispersión del cerebro, el cráneo debe ser diluido a por lo menos 55 micras de profundidad de penetración óptima. Una lista de los materiales utilizados se proporcionan en la Tabla 1.

3. Tomografía de Coherencia Óptica de imagen

1. Después de la cirugía se ha completado, compruebe tasa de respiración de los animales y los reflejos para asegurar un nivel adecuado de anestesia y administrar anestesia adicional si es necesario. Eliminar el animal a la estructura estereotáxica, mantener los animales envuelto en paños quirúrgicos, y el transporte de animales a la estación de formación de imágenes.
2. Antes de imágenes para verificar si existen signos reflejos y aplicar lágrimas artificiales adicional si es necesario. Montar los animales en el marco estereotáxico para asegurar el cráneo.
3. Lugar animal bajoOctubre cámara y la posición de la TSCW bajo el haz óptico (Figura 2). Una vista en sección transversal del cráneo y el cerebro ahora se puede visualizar (Figura 3).
4. La adquisición de datos puede comenzar una vez área de interés se encuentra. Para los propósitos de formación de imágenes, se utiliza espejos galvo para conseguir una ventana de imagen con una anchura de 4,0 mm. Una profundidad de imagen de 2 mm se obtuvo con 6 mW de potencia incidente y un punto focal 1 mm por debajo del cráneo adelgazada. Cada área transversal consistió de 2.048 cortes axiales con una velocidad de adquisición de 0,14 seg por imagen.
5. Exploraciones volumétricas del cerebro también se puede obtener mediante la recopilación de una serie de 2D imágenes transversales mediante el uso de dos conjuntos de espejos galvo de barrido XY con la primera espejo galvo barrido del haz en la dirección sagital y el segundo espejo de escaneo galvo en el coronal dirección.

Resultados

Después de crear una ventana adelgazada sobre la corteza cerebral de la vasculatura ahora debería ser más visualmente prominente (Figura 1) y permitirá una profundidad de imagen más profundo (hasta 1 mm). La corteza derecha se adelgaza a aproximadamente 55 micras, en comparación con un cráneo normal medido a 140 micras (figura 1) y proporciona una mayor claridad óptica. Además adelgazamiento a 10-15 micras es posible ¹¹ no obstante, es necesario que el uso de cubreobjetos de ...

Discusión

Proyección de imagen con OCT y un cráneo adelgazado-es una novela de neuroimagen técnica que sólo se ha investigado recientemente ^{15, 16.} En nuestros experimentos, hemos demostrado la viabilidad de la SD-OCT imágenes a través de un TSCW en un modelo de ratón in vivo. A partir de nuestros resultados, el cráneo se adelgaza a aproximadamente 55 micras y con la profundidad de penetración se obtiene en aproximadamente 1 mm con una resolución de imagen de 8 micras y 20 micras en la dirección axial y latera...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Materiales	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
La ketamina	Phoenix Pharmaceuticals	57319-542-02
Xilazina	Akorn, Inc.	139-236
Lágrimas artificiales Ungüento	Rugby	0536-6550-91
Nair	Church & Dwight Co., Inc.	4010130
Estéril Alcohol Prep Pad	Kendall Healthcare	6818
Aplicadores con punta de algodón	Fisherbrand	23-400-115
Betadine solución bastoncillo con hisopo	Purdue Productos	67618-153-01
Solución salina, 0,9%	Phoenix Pharmaceuticals	57319-555-08
Estereotáctica Frame	Stoelting
Alta velocidad Taladro quirúrgico	Foredom		38.000 rpm
Carburo de fresa redonda	Stoelting		0,75 mm
Dura-Green Stones	Shofu		Shank: HP Forma: BA1
CompoMaster gruesa y pulidora CompoMaster	Shofu		Forma: Mini-Pt.
SpaceDrapes	Braintree Scientific, Inc.