Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Félix Legendre; Neal Cody; Carole Iampietro; Julie Bergalet; Fabio Alexis Lefebvre; Gaël Moquin-Beaudry; Olivia Zhang; Xiaofeng Wang; Eric Lécuyer

doi:10.3791/50057

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Todo el monte ARN fluorescente

18.2K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/50057

⸱

30 de enero de 2013

Félix Legendre^*¹^,² , Neal Cody^*¹ , Carole Iampietro¹ , Julie Bergalet¹ , Fabio Alexis Lefebvre¹^,² , Gaël Moquin-Beaudry¹^,² , Olivia Zhang¹ , Xiaofeng Wang¹ , Eric Lécuyer¹^,²

¹Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), ²Department of Biochemistry, Université de Montréal

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí se describe un fluorescente de todo el montaje In situ Hibridación (FISH) protocolo para determinar las propiedades de expresión y localización de ARN expresados durante la embriogénesis en la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster.

Resumen

Evaluar el patrón de expresión de un gen, así como las propiedades de localización subcelular de sus ARN transcrito, son características clave para la comprensión de su función biológica durante el desarrollo. ARN hibridación in situ (ISH-RNA) es un poderoso método utilizado para la visualización de las propiedades de ARN de distribución, ya sea a nivel organismal, celular o subcelular ^1. ARN-ISH se basa en la hibridación de una sonda de ácido nucleico marcada (por ejemplo, ARN antisentido, oligonucleótidos) complementaria a la secuencia de un ARNm o un objetivo no codificante de ARN de interés ^2. A medida que el procedimiento requiere información de la secuencia primaria por sí sola para generar sondas específicas de secuencia, que puede aplicarse universalmente a una amplia gama de organismos y muestras de tejido ^3. De hecho, un número de estudios a gran escala ISH se han implementado para documentar la expresión génica y ARN dinámica de localización en diversos organismos modelo, que ha llevado a laestablecimiento de recursos comunitarios importantes ^4-11. Mientras que una variedad de la sonda de etiquetado y estrategias de detección se han desarrollado a lo largo de los años, el uso combinado de los reactivos de detección marcadas con fluorescencia y enzimáticas pasos de amplificación de señal ofrecen mejoras significativas en la sensibilidad y la resolución del procedimiento ^12. A continuación, describimos un fluorescente optimizado método de hibridación in situ (FISH) utilizando amplificación de la señal tiramida (TSA) para visualizar la expresión del ARN y la dinámica de localización en una puesta de embriones de Drosophila. El procedimiento se lleva a cabo en 96-y formato de placa de PCR, lo que facilita en gran medida el procesamiento simultáneo de grandes números de muestras.

Protocolo

1. Sonda de ARN Preparación

Resumen: En la siguiente sección se describen los pasos necesarios para hacer digoxigenina (DIG)-etiquetados sondas de ARN para el pescado. El primer paso implica la clonación o la PCR de la secuencia correspondiente a la región transcrita de un gen de interés que se utilizará para generar una sonda específica de secuencia. Esto se puede lograr por clonación primero el segmento de gen en un plásmido en el que está flanqueado el sitio de clonación múltiple por elementos promotores de bacteriófagos (T7, T3 o SP6), que puede entonces servir como una plantilla para PCR usando cebadores flanqueantes q....