Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Resumen

Se describe una sola célula de alto rendimiento de ensayo para medir la citotoxicidad de las células T cuando se incuba con las células diana tumorales. Este método emplea una matriz densa, elastómero de sub-nanolitros pozos (~ 100.000 pozos / matriz) para confinar espacialmente las células T y las células diana en proporciones definidas, y está acoplado a la microscopía de fluorescencia para monitorizar efector-diana conjugación y posterior apoptosis.

Resumen

Inmunoterapia del cáncer puede aprovechar la especificidad de la respuesta inmune para atacar y eliminar tumores. Terapia celular adoptiva (ACT) sobre la base de la transferencia adoptiva de células T modificadas genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) ha mostrado una promesa considerable en los ensayos clínicos ^1-4. Hay varias ventajas de utilizar CAR ⁺ células T para el tratamiento de cánceres, incluyendo la capacidad de apuntar no-MHC antígenos restringidos y para funcionalizar las células T para la supervivencia óptima, mensajeras y persistencia dentro del huésped, y finalmente para inducir la apoptosis de CAR ⁺ células T en el caso de toxicidad para el huésped ^5.

La delineación de las funciones óptimas de CAR ⁺ células T asociados con un beneficio clínico es esencial para el diseño de la próxima generación de ensayos clínicos. Los recientes avances en imágenes de animales vivos como microscopía multifotónica han revolucionado el estudio de la función celular inmune in vivo ^6,7. Aunque estos estudios han avanzado nuestra comprensión de las funciones de las células T in vivo, las células T ACT basada en ensayos clínicos, requiere la necesidad de vincular las características moleculares y funcionales de las células T preparaciones de pre-infusión con eficacia clínica después de la infusión, utilizando en ensayos in vitro de vigilancia de células T como las funciones, la citotoxicidad y la secreción de citoquinas. Estándar de citometría de flujo basados ​​en ensayos han sido desarrollados que determinan el funcionamiento general de las poblaciones de células T a nivel de una sola célula, pero estos no son adecuados para el seguimiento de la formación de conjugado y tiempos de vida o la capacidad de la misma célula para matar múltiples objetivos ^8.

Arrays microfabricados diseñado en polímeros biocompatibles, como el polidimetilsiloxano (PDMS) son un método particularmente atractivo para confinar espacialmente efectores y objetivos en volúmenes pequeños ^9. En combinación con la microscopía de fluorescencia automatizado time-lapse, aunqueusands de interacciones efector-objetivo pueden ser controlados simultáneamente por los distintos pozos de imágenes de una gran nanowell. Se presenta aquí una metodología de alto rendimiento para el seguimiento de la citotoxicidad de células T mediada a nivel de una sola célula que puede aplicarse ampliamente para estudiar la funcionalidad de las células T citolítica.

Protocolo

1. Reactivos Preparación

1. Preparar RPMI-PLGH mediante la mezcla de 500 ml ml de RPMI-1640 y 5 de cada uno de penicilina-estreptomicina, L-glutamina, y la solución de HEPES.
2. Preparar R10 solución mediante la mezcla de RPMI-PLGH con suero fetal bovino al 10% (FBS). El FBS es inactivado por calor a 56 ° C durante 30 min antes de la adición.
3. Pre-caliente a 37 º C 50 ml de medio RPMI-PLGH, 15 ml ml de PBS, y 15 de R10 en tubos cónicos estériles.
4. Fabricación de matrices de nanowells en PDMS: El maestro de silicio se fabrica utilizando fotolitografía esencialmente como se describe anteriormente ^10. Mezclar bien la base de S....

Resultados

Un ejemplo de la aplicación del ensayo citolítico de alto rendimiento se demuestra en la Figura 2. Brevemente, etiquetado específico CD19-CAR ⁺ células T se co-incubaron con células diana marcadas ratón EL4 en los pocillos individuales de una matriz de nanowell (Secciones 1-5). Una imagen inicial se registró en el microscopio fluorescente automatizada para identificar la ocupación (efectores y / o metas) de todos y cada uno nanowell en la matriz (Sección 6). El procesamiento de imágenes se ut.......

Discusión

Hemos esbozado el protocolo para un alto rendimiento de una sola célula ensayo citolítico habilitado a través de co-incubación de los efectores y metas en las matrices de nanowells (Figura 1). Además de rendimiento de una de las principales ventajas de la técnica es la capacidad de controlar efectora mediada por la citotoxicidad contra células diana deseadas sin la necesidad de la ingeniería de las células diana que a su vez permite el uso de células tumorales autólogas o apareadas / primaria como célul.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo / material	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI-1640 w / o L-glutamina	Cellgro	15-040 CV-
Penicilina-estreptomicina	Cellgro	30 a 002-CI	10.000 UI de penicilina 10.000 g / ml estreptomicina
L-glutamina	Cellgro	25 a 005-CI	200 mM de solución
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Suero fetal bovino (FBS)	Atlanta Biológicos	S11150	Lote probado
Cell Tracker mancha roja	Invitrogen	C34552	50 g
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
Sytox ácido nucleico mancha verde	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 l
PBS de Dulbecco	Cellgro	21-031 CV-	500 ml
Agar Noble	DIFCO	2M220	100 g
Azul de tripano	Sigma Aldrich	T8154	0,4% de líquido, se filtró estéril
Hemocitómetro	Hausser Científicos	1492	Bright línea
4 pocillos	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Basic limpiador de plasma
Observer.Z1	ZEISS		Microscopio de fluorescencia (trabaja con las tres partes abajo)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Filtro regulador
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra-alta velocidad de conmutación de longitud de onda
Hamamatsu EM-CCD cámara	Hamamatsu	C9100-13	Microscopio cámara CCD-
Tubo cónico de 15 ml	BD Falcon	352097
Tubo cónico de 50 ml	VWR	3282-345-300
Nikon BioStation	Nikon Instruments Inc.	BioStation IM
Fondo de cristal placa de cultivo	MatTek Corporación	P35G-0	35 mm placa de Petri de 10 mm micropocillo