La visualización de los ARNm retículo endoplásmico localizados en células de mamíferos

Resumen

Aquí se describe un método para visualizar retículo endoplasmático asociados mRNAs en células de cultivo de tejidos de mamíferos. Esta técnica implica la permeabilización selectiva de la membrana plasmática con digitonina para eliminar el contenido citoplásmico seguido por fluorescente In situ a detectar sea a granel poli (A) mRNA o transcripciones específicas.

Resumen

En eucariotas, la mayoría de los ARN mensajeros (ARNm) que codifican proteínas de membrana y secretada están localizados en la superficie del retículo endoplásmico (ER). Sin embargo, la visualización de estos mRNAs puede ser un reto. Esto es especialmente cierto cuando sólo una fracción del ARNm es ER-asociado y su distribución a este orgánulo es obstruida por no objetivo (es decir, "libre") transcripciones. A fin de supervisar ER-asociados mRNAs, hemos desarrollado un método en el que las células se tratan con una corta exposición a una solución de extracción que digitonina selectivamente permeabiliza la membrana plasmática, y por lo tanto elimina los contenidos citoplásmicos, manteniendo al mismo tiempo la integridad de la ER . Cuando este método se acopla con hibridación in situ fluorescente (FISH), uno puede visualizar claramente ER-mRNAs unidos por microscopía fluorescente. Usando este protocolo el grado de ER-asociación, ya sea para granel de poli (A) o transcripciones de ARNm específicos puede evaluarsee incluso cuantificados. En el proceso, se puede utilizar este ensayo para investigar la naturaleza de las interacciones ER-mRNA.

Introducción

En eucariotas, el ARNm que codifica secretadas y proteínas de membrana pueden ser dirigidos a la ER co-traduccional por la partícula de reconocimiento de señal de ^1,2 y se puede mantener en el ER a través de las interacciones directas entre los ribosomas y translocons durante la traducción ^3,4. Sin embargo, si mRNAs pueden ser dirigidos y mantenidos en la sala de emergencia independiente de cualquiera de los ribosomas o la traducción no está claro hasta muy recientemente. Estudios previos tratado de abordar la existencia de traducción independiente de la asociación con el mRNA ER utilizando técnicas de fraccionamiento celular. Debido a las duras....

Protocolo

1. Preparación de los materiales para la extracción

1. Preparación de las células
   1. Semillas células de cultivo de tejidos en cubreobjetos tratados con ácido para al menos un día antes del experimento. Usamos COS-7 o U2OS, como estas dos líneas celulares exhiben producción de proteína secretada robusto y tener una bien definida ER. Tenga en cuenta que para lograr una eficiencia de extracción de alta, las células no debe exceder de 80% de confluencia en el cubreobjetos en el día del experimento.
   2. Si un ARNm exógeno particular, está siendo investigado, las células se transfectan un día después de la siembra con plásmidos que contienen el gen de ....

Resultados

Para determinar el porcentaje de ARNm que es ER-asociado, células COS-7 que se transfectaron con plásmidos que contenían la fosfatasa alcalina placentaria (MF) o el citocromo P450 8B1 (CYP8B1) se extrajeron bien con digitonina y luego se fija, o fijada directamente (véase la Figura 1, comparar "no extraído Ctrl" a "Extraídas Ctrl"). La fluorescencia no nuclear se cuantificó en ambas muestras y la fracción de ER asociada a ARNm se calculó (Figura 2). Nuestros datos mues.......

Discusión

La localización de los ARNm a varios sitios subcelulares, a través de la interacción con las proteínas de las transcripciones de ARNm de localización, es un fenómeno generalizado importante para la selección adecuada de las proteínas a su destino final, y para el ajuste fino de la expresión de genes a los requisitos locales de una subcelular ^19,20 región.

Usando el ensayo descrito aquí, se volvió a examinar la cuestión de si los ARNm que codifican proteínas de secreción puede mant.......