En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

Elad Noy; Maor H. Pauker; Mira Barda-Saad

doi:10.3791/50076

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Artículo de método

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

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DOI:

10.3791/50076

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23 de junio de 2013

Elad Noy^*¹ , Maor H. Pauker^*¹ , Mira Barda-Saad¹

¹The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se describe un método de imágenes de células vivas que da una idea de la dinámica de proteínas durante el proceso de activación de células T. Se demuestra el uso combinado de la T-célula ensayo de difusión, microscopía confocal y análisis de imágenes para producir resultados cuantitativos para seguir la formación de complejos de señalización a través de la activación de células T.

Resumen

Protección contra enfermedades infecciosas está mediada por el sistema inmune ^1,2. Los linfocitos T son los coordinadores maestros del sistema inmune, la regulación de la activación y respuestas de múltiples células inmunes ^3,4. Activación de células T es dependiente en el reconocimiento de antígenos específicos mostrados por las células presentadoras de antígenos (APC). El receptor de antígeno de células T (TCR) es específica de cada clon de células T y determina la especificidad antígeno ^5. La unión del TCR al antígeno induce la fosforilación de los componentes del complejo TCR. Con el fin de promover la activación de células T, esta señal debe ser transducidas desde la membrana hasta el citoplasma y el núcleo, iniciar varias respuestas cruciales tales como el reclutamiento de las proteínas de señalización al TCR; sitio de APC (la sinapsis inmunitaria), su activación molecular, reordenamiento del citoesqueleto, elevación de la concentración de calcio intracelular, y cambios en la expresión génica ^6,7. La correcta enitiation y terminación de señales de activación es crucial para las respuestas de células T apropiadas. La actividad de las proteínas de señalización depende de la formación y la terminación de las interacciones proteína-proteína, modificaciones post traduccionales tales como fosforilación de proteínas, la formación de complejos de proteínas, ubiquitylation proteína y el reclutamiento de proteínas a varios sitios celulares ^8. La comprensión de los mecanismos internos del proceso de activación de las células T es crucial tanto para la investigación inmunológica y sus aplicaciones clínicas.

Varios ensayos se han desarrollado con el fin de investigar las interacciones proteína-proteína, sin embargo, los análisis bioquímicos, tales como el método de co-inmunoprecipitación ampliamente utilizado, no permiten ubicación proteína que discernir, lo que impide la observación de información valiosa sobre la dinámica de celulares mecanismos. Además, estos ensayos a granel por lo general se combinan las proteínas de muchas células diferentes que podrían estar en diferentes etapas de la tinvestigó proceso celular. Esto puede tener un efecto perjudicial sobre la resolución temporal. El uso de imágenes en tiempo real de células vivas permite que tanto el seguimiento espacial de las proteínas y la capacidad de distinguir entre eventos de señalización temporal, perdiendo por lo tanto la luz sobre la dinámica del proceso de ^9,10. Se presenta un método de formación de imágenes en tiempo real de la formación de complejos de señalización-durante la activación de células T. Células T primarias o líneas de células T, tales como Jurkat, se transfectaron con plásmidos que codifican para las proteínas de interés fusionados a proteínas fluorescentes monoméricos, la prevención de oligomerización no fisiológica ^11. Vivir las células T se dejan caer sobre un cubreobjetos de pre-revestido con anticuerpo activador de células T ^8,9, que se une al complejo CD3/TCR, inducir la activación de células T, mientras que la superación de la necesidad de activación de antígenos específicos. Las células activadas son constantemente obtuvieron imágenes con el uso de la microscopía confocal. Los datos de imagen se analizan para dar resultados cuantitativos, tales como la colcoeficiente ocalization de las proteínas de señalización.

Protocolo

1. La transfección de células T

Preparar la solución Nucleofector Amaxa activado mezclando solución "Suplemento" del kit de la Solución Nucleofector. La solución activada se puede almacenar a 4 ° C durante hasta tres meses.
Se cultivan las células T Jurkat en medio de cultivo [10% de suero fetal de ternera (FCS), solución de penicilina-estreptomicina al 1%, y 2 mM de L-glutamina en RPMI]. De manera óptima, las células se deben utilizar 1-2 semanas después de la descongelación. Uso de cultivos de células en crecimiento logarítmico es crucial para una alta eficiencia de transfección y la supervivencia celular. Alternativamente, con modificaciones menores, este protocolo se puede utilizar con las células T primarias, como se ha descrito previamente ^8. Cabe destacar que a medida que la duración del proceso de activación de las células T primarias es más larga que la de las células Jurkat T (~ 30 min), una platina del microscopio montado sistema de incubación debe ser utilizado para mantener CO _2, los niveles de humedad y de temperatura durante todo el activación de procesos.
Recoger 5× 10 ⁶ log-fase de las células T por transfección en un tubo de 15 ml.
Centrifugar las células durante 7 minutos a 400 x g a temperatura ambiente.
Durante la centrifugación, preparar una placa de 6 pocillos. Llenar un pozo para cada transfección con 5 ml de medio de cultivo, y pre-incubar a 37 ° C.
Recoge los tubos de la centrífuga y descartar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en 1 ml de RPMI.
Centrifugar las células durante 7 minutos a 400 x g a temperatura ambiente.
Durante la centrifugación, preparar la solución de transfección. En un pocillo de una placa de 96 pocillos, mezclar 100 l solución de Nucleofector Amaxa activado preparado en la etapa 1 con 5 g de ADN del plásmido de interés que codifica una proteína marcado con fluorescencia. De manera óptima, la concentración de ADN debe ser mayor que 1 g / ml con el fin de evitar la dilución de la solución de transfección.
Mezclar bien mediante pipeteo suave.
Después de la centrifugación de las células, eliminar cuidadosamente todo el sobrenadante, mientras que no disturbing el sedimento.
Pipetear la solución de ADN / transfección dos veces.
Añadir la solución de ADN / transfección de la pastilla.
Transferir las células a la Amaxa cubeta.
Inserte la cubeta en el dispositivo Nucleofector Amaxa.
Use el ajuste de H-10 Amaxa transfección para la electroporación (por Jurkat) o T-23 (para las células T primarias).
Retire la placa de 6 pocillos de la incubadora.
Después de la electroporación, transferir cuidadosamente el sobrenadante con la suspensión de células a la placa de 6 pocillos usando una pipeta Pasteur. Un pellet que consiste en restos de células puede formar. Evitar la transferencia de la pastilla.
Se incuban las células durante 24 horas a 37 ° C.
Transferir 2,5 ml de suspensión de células de cada pocillo en un nuevo pozo. Añadir 2,5 ml de medio de cultivo caliente (descrito en el paso 2) a cada pocillo.
Después de 72 horas, transferir las células a un tubo estéril y se centrifuga durante 7 min a 400 x g a temperatura ambiente. Descartar el sobrenadante y reemplazarlo wiª medio de cultivo suplementado con el antibiótico de selección de células de mamífero apropiado para el plásmido utilizado (aplicar una concentración adecuada para los antibióticos utilizados; se utilizó G418 y / o higromicina en concentraciones de 1,3 mg / ml y / o 0,2 mg / ml, respectivamente). Cultura de la suspensión celular en un lugar bien fresco. Alternativamente, las células pueden ser transfectadas transitoriamente y la imagen 48 horas después de la transfección. Para preparar las células transfectadas transitoriamente, co-transfectar las células con los dos plásmidos simultáneamente en el paso 8, continuando normalmente al paso 20 y vaya directamente al paso 23. Tenga en cuenta que, en este caso, las células deben ser utilizados de inmediato, y en general la intensidad de fluorescencia es heterogénea y no necesariamente alta.
Se cultivan las células con medio de cultivo suplementado con el antibiótico de selección adecuado. Dividir las células y complementarlos con medio de cultivo suplementado con antibióticos si es necesario.
Después de 2 semanas, verificar la transfección con éxito con el uso de FACS (gripeclasificación de células activada por orescence) como sigue:
Recoger 10 ⁶ células transfectadas, 10 ⁶ células transfectadas de forma simulada (control negativo), y 10 ⁶ células que se sabe que expresan de forma estable la proteína marcado con fluorescencia. Si las células son transfectadas con más de una proteína fluorescente (véase el paso 27), utilizar varias líneas celulares, individualmente etiquetados como controles positivos.
Centrifugar las células durante 7 minutos a 400 x g a temperatura ambiente.
Descartar el sobrenadante. Resuspender las células en 500 l tampón FACS (PBS w / o Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +,} 5% FCS, 0,05% de azida de sodio).
Utilice un FACS analíticos para verificar la fluorescencia celular. Comparación de fluorescencia de las células transfectadas a la de los controles positivos y negativos.
Para transfectar las células con un adicional, marcado con fluorescencia de proteínas, repita los pasos 3-26 utilizando las células transfectadas.
Las células que muestran altos niveles de fluorescencia se deben utilizar. De manera óptima, al menos el 50% de loslas células en el cultivo deben ser altamente fluorescente. Fluorescencia celular puede ser aumentado por clasificación de células a través de FACS.

Las proteínas etiquetadas adicionales deben ser fusionadas con diferentes fluoróforos y ser codificados en plásmidos que codifican para diferentes antibióticos de selección. El medio de selección para células transfectadas con más de un plásmido debe complementarse con todos los antibióticos apropiados.

2. De células T Difusión Preparación del ensayo

Use Lab-Tek II sistema cubreobjetos German 4 cámara de diapositivas. Asegúrese de no rayar accidentalmente la superficie interior de las cámaras, por ejemplo, con una punta de pipeta, durante la preparación o uso.
Preparar solución de preparación de los portaobjetos de 50 ml: Tomar 4,6 ml de 12 M (37%) de HCl, añadir 38,5 ml de etanol al 100%, y 6,9 ml de agua doblemente destilada.
Llene cada cámara de la diapositiva con 500 l solución de la preparación de diapositivas.
Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
Aspirar la cámaras, secado por completo.
Incubar los portaobjetos descubiertas durante 1 hora a 45 ° C hasta que se seque completamente.
Preparar la solución de poli-L-lisina 0,01% mediante la dilución de 0,1% de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) en agua destilada doble.
Aplicar 500 l de cada cámara.
Incubar el portaobjetos durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Aspirar las cámaras, secado por completo.
Incubar durante 3 horas a 45 ° C hasta que se seque completamente.
Portaobjetos recubiertos se pueden almacenar en seco durante varios meses a temperatura ambiente.
Preparar una solución de anticuerpo activador. Usar un anticuerpo anti-CD3: ya sea HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) o UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 mg / ml en 400 l de PBS, por cámara. Esta solución debe prepararse poco antes de la preparación de los portaobjetos.
Llene cada compartimiento con 400 l de la solución de anticuerpo activador.
Incubar el portaobjetos durante 2 horas a 37 ° C o, preferiblemente, durante la noche a 4 ° C.
Retire el anticuerpo activador sollución y lave de inmediato la cámara dos veces con 300 l de PBS. Desde este punto, asegúrese de que las cámaras permanecen llenos de buffer.
Guarde la diapositiva PBS-llenado a 4 ° C. Sugerimos el uso de las cámaras de diapositivas preparadas dentro de 1 semana.

3. La activación de células T e Imagen

Preparar buffer de imágenes [ml de HEPES 1,25 M (1), 10 ml de FCS, 38,75 ml de RPMI sin rojo de fenol]. Buffer de imágenes se puede almacenar a 4 ° C después de la filtración.
Active el LSM 510 microscopio Zeiss Meta. Caliente el marco de montaje climatizada microscopio para 37 ° C. Seleccione "Modo experto".
Haga clic en la pestaña "Adquirir" y abrir las siguientes fichas: Lasers, Microscopía, configuración, exploración, Series de Tiempo.
Activar el láser necesarios. Para la excitación de MCFP y MyEP, ajuste el Argón / 2 láser "en espera" durante 5 minutos, a continuación, en "on".
Si ha realizado este análisis de imágenes de células vivas antes, utilizando los mismos fluoróforos, abra el archivo LSM resultante, haga clic en la "reutilización" iacondicionado, y continúe desde el paso 9. Lo contrario, continúe en el paso 6.
Definir canales utilizando filtros adecuados para la excitación y la emisión de las proteínas fluorescentes utilizados.
En la ventana "Scan control", seleccione la opción pila Z.
Introduzca los siguientes parámetros de análisis: Cantidad de rebanadas: 5; intervalo: 0,5 m; rebanada actual: 3.
Preparar un baño de Accublock digital en seco (Labnet) a 37 ° C cerca del microscopio.
Caliente el buffer de imágenes a 37 ° C.
Preparar la diapositiva almacenada por aspirar el PBS, reemplazándolo con 600 l de buffer de imágenes calientes.
Incubar el portaobjetos a 37 ° C. Mantenga la diapositiva en la incubadora hasta el paso 13, durante al menos 15 min.
Recoge 5 × 10 ⁵ células T transfectadas.
Centrifugar las células durante 2 minutos a 400 x g.
Descartar el sobrenadante.
Resuspender las células en 1 ml de buffer de imágenes caliente, y transferirlos a un tubo Eppendorf de 1,5 ml.
Coloque el ttubo est en el baño seco Digital Accublock.
Tome el carro caliente de la incubadora, y montarlo en el bastidor de montaje microscopio calentado.
Haga clic en el icono "VIS".
Mezclar la suspensión de células y eliminar 1-2 l.
Insertar la punta de la pipeta en el buffer de imágenes por encima de la parte inferior de la diapositiva. Evite rayar la diapositiva.
Semillas de las células sobre la apertura del objetivo.
Inmediatamente comenzar el seguimiento visual de las células fluorescentes a medida que descienden. Seleccione una celda que muestra alta fluorescencia en ambos canales.
Antes de la célula alcanza la superficie de la corredera, activar el modo de LSM.
Activar sólo un láser de excitación. Seleccione un láser para los que tiene un canal de DIC.
Ajuste zoom a 1. Haga clic en el icono de "Fast XY". Haga clic en el icono de "Stop". Con la herramienta Recortar, seleccione un retorno de la inversión centrada en la célula.
Ajuste zoom de 3. Haz clic en el icono de "Fast XY", luego ajuste manualmente el enfoque para ver la forma óptima de la célula. Haga clic en "Stop" icon.
Cambia todos los láseres de excitación necesarios.
Inicie la grabación haciendo clic en el icono "stARTT". Imagen de la célula para la totalidad del proceso de difusión (comúnmente 5 minutos). Cuando haya terminado, haga clic en el icono de "Stop".
Guarde el archivo.
Para adquirir celdas adicionales, haga clic en el icono "VIS". Si hay células que aún no han entrado en contacto con la parte inferior de la diapositiva, continúe desde el paso 23. Evite las células de imágenes que ya han comenzado el proceso de difusión. De lo contrario vaya al paso 32.
Si el área de deslizamiento observado es en su mayoría carentes de células, añadir otra alícuota de células (continúe desde el paso 20). De lo contrario vaya al paso 33.
Para adquirir células adicionales, mover la corredera de manera que el área por encima de la abertura del objetivo es desprovisto de células.
Añadir otra alícuota de células (y continúe desde el paso 20).
Después de realizar todas las imágenes que desee, abra un archivo LSM guardado.
Haga clic en la "Galería", "Time + Z" y "Subset".
Seleccione la relevant intervalo de tiempo y la pila Z.
Guarde el nuevo archivo.
Realice los pasos 35 a 38 para todos los archivos de imagen.

4. Análisis de datos de imágenes

Abrir los archivos con el software LSM Imaris (Bitplane AG, Zurich Suiza).
Haga clic en "Supera". Haga clic en el menú "Procesamiento de imágenes", y seleccione "Swap tiempo y Z". Esto ayudará en el cultivo correcto de la imagen.
Haga clic en la barra de herramientas "Editar" y seleccione la opción "3D Recortar" en el menú desplegable. Recortar la imagen para incluir sólo el área que rodea la célula. Le sugerimos recortar un cuadrado de 300 píxeles x 300 centrado en la célula. Tenga en cuenta que la forma y la ubicación de la celda pueden cambiar con el tiempo. Observando el eje t, asegúrese de que la celda está dentro de la región recortada en todos los puntos.
Haga clic en el menú "Procesamiento de imágenes", y seleccione "Swap tiempo y Z" para restaurar la separación temporal original de la imagen.
Pulse el botón "Coloc" en la barra de herramientas principal. Seleccione "Crear Tiempo Dep. COLOC ". Imaris calculará automáticamente umbrales de intensidad para cada canal en cada punto de tiempo.
Vea los resultados de los análisis de colocalización seleccionando "Estadísticas Canal". Exportar los datos haciendo clic en "Exportar".
Repita los pasos 1 a 6 para cada celda de imágenes. Se recomienda que al menos 50 células se analizaron de esta manera.
Calcular el coeficiente medio colocalización de Pearson y su error o desviación estándar.