Aislamiento y cultivo de astrocitos corticales de ratones

Resumen

Los astrocitos se han reconocido para ser versátiles células que participan en los procesos biológicos fundamentales que son esenciales para el desarrollo normal del cerebro y la función, y la reparación del sistema nervioso central. Aquí presentamos un procedimiento rápido para obtener cultivos puros de astrocitos de ratón para estudiar la biología de esta clase importante de centrales células del sistema nervioso.

Resumen

Los astrocitos son un tipo de células abundante en el cerebro de los mamíferos, pero aún queda mucho por aprender acerca de sus características moleculares y funcionales. Astrocitos in vitro de sistemas de cultivo celular se puede utilizar para estudiar las funciones biológicas de estas células gliales en detalle. Este protocolo video muestra cómo obtener los astrocitos puras mediante el aislamiento y la cultura de una mezcla de células corticales de crías de ratón. El método se basa en la ausencia de neuronas viables y la separación de los astrocitos, los oligodendrocitos y microglia, las tres poblaciones principales de células gliales del sistema nervioso central, en cultivo. Imágenes representativas durante los primeros días de cultivo demostrar la presencia de una población de células mixtas e indicar el punto de tiempo, cuando los astrocitos se hacen confluentes y debe ser separado de microglia y oligodendrocitos. Por otra parte, se demuestra la pureza y la morfología astrocytic de astrocitos en cultivo utilizando tinciones inmunocitoquímicas para bien establecidos yrecién descrito marcadores de astrocitos. Este sistema de cultivo puede ser fácilmente utilizado para obtener los astrocitos puros ratón y el medio acondicionado de astrocitos para el estudio de diversos aspectos de la biología de astrocitos.

Introducción

Los astrocitos son un tipo de célula muy abundantes en el sistema nervioso central (SNC). La relación de los astrocitos de las neuronas es de 1:3 en la corteza de ratones y ratas, mientras que hay 1,4 astrocitos por neurona en la corteza humana ^1. El interés en función de los astrocitos se ha incrementado dramáticamente en los últimos años. Una función clave de los astrocitos es su papel en la prestación de apoyo estructural y metabólico de las neuronas ^2,3. Papeles recién descubiertas de astrocitos cubren un amplio espectro de funciones. Estos incluyen guiar la migración de los axones en desarrollo y los neuroblastos determinadas durante el des....

Protocolo

1. El aislamiento y forro de una mezcla de células corticales

Aislamiento de células mixtas para cultivos de astrocitos corticales se puede realizar utilizando P1 a P4 crías de ratón. Con el fin de conseguir una densidad de astrocito adecuado, es necesario el uso de 4 capas corticales de ratón pup por T75 matraz de cultivo de tejido. Por lo tanto, los volúmenes en el protocolo siguiente se calculan para una preparación de células usando 4 crías de ratón.

1. Antes de iniciar el procedimiento de disección, precalentamiento 30 ml de medios de cultivo de astrocitos (DMEM, alta glucosa + 10% inactivado por calor suero fetal bovino + 1%....

Resultados

Tras el aislamiento del cerebro de ratón completo (Figura 1A), el cerebelo y el bulbo olfativo tiene que ser eliminado (Figura 1B). Las cortezas se pelan del vástago de cerebro de ratón (Figura 1C) y de las meninges de la corteza individual (Figura 1D ') se retiran cuidadosamente (Figura 1E). Meninges son evidentes por el sistema de la arteria meníngea y resultados incompletos de eliminación de contaminación en el cultivo de astroci.......

Discusión

El método descrito aquí se basa en la preparación de cultivo de astrocitos a partir de cerebros de roedores neonatos, originalmente descrito por McCarthy y de Vellis en 1980 ^27. El método modificado del aislamiento y el cultivo de astrocitos corticales a partir de P1 a P4 postnatal cerebro de ratón se presenta aquí es rápido, los rendimientos de los astrocitos primarios puros y es altamente reproducible. Esta técnica se puede transferir fácilmente para aislar los astrocitos a partir de otras especies, tales c.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre de la solución de trabajo	Empresa	Número de catálogo	Concentración final
			Medios de cultivo de astrocitos
DMEM, alta glucosa	Life Technologies	31966-021
FBS, inactivado por calor	Life Technologies	10082-147	Concentración final: 10%
Penicilina-Estreptomicina	Life Technologies	15140-122	Concentración final: 1%
			Solución para la excavación del tejido cerebralestion
HBSS	Life Technologies	14170-088
2,5% de tripsina	Life Technologies	15090-046	Concentración final: 0,25%
			Otro
70% (vol / vol) de etanol	Roth	9065.2
Poli-D-lisina	Millipore	A-003-E	50 ug / ml
Agua	PAA	S15-012	grado celda de la cultura
PBS	PAA	H15-002	grado celda de la cultura
Trate de 0,05%psin-EDTA	Life Technologies	25300-062
0,45 filtro estéril micras	Sartorio	16555
3,5 cm plato de Petri	BD Falcon	353001
15 ml Falcon tubo	BD Falcon	352096
50 ml Falcon tubo	BD Falcon	352070
75 cm 2 matraz de cultivo tisular	BD Falcon	353136
Pinzas, bien	Dumont	2-1032, 2-1033	# 3c, # 5
Pinzas, punta plana	KLS Martin	12-120-11
13 cm tijeras quirúrgicas	Aesculap	BC-140-R
Estereomicroscopio	Leica		MZ7.5
Estereomicroscopio + cámara	Leica		MZ16F; DFC320
Microscopio con cámara +	Zeiss, Canon		Primo Vert; PowerShot A650 IS
Centrífugo	Eppendorf	5805000.017	Centrifuge5804R
Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
Baño de agua	Julabo		SW20, 37 ° C