$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Clonación y Diseño Construct
Clonar las secuencias de interés en el vector de PMM-péptido (que se puede proporcionar a petición) usando HindIII y sitios de restricción BamHI (véase la Figura 1). El inserto de ADN de doble hebra deben incorporar, en el orden siguiente: un sitio HindIII; un solo codón metionina para la escisión con CNBr, la E. coli codón optimizado péptido secuencia de codificación, un codón de parada, un sitio BamHI. Todas las metioninas otros en el péptido debe ser eliminada y la secuencia de dipéptido asp-pro se debe evitar ya que también se puede escindir en condiciones ácidas.
Un único residuo de cisteína debe ser introducido en cada secuencia de péptido de acuerdo con el posicionamiento deseado de la reticulación de disulfuro en el complejo final, y todas las otras cisteínas debe ser mutado a serina. El plásmido lleva un casete de resistencia a kanamicina para la selección.
2. Expresión de trpLE-Peptide Fusión
- Maquillaje y filtro estéril medio M9/Kan mínimo crecimiento (0,1 mM CaCl 2, 2 mM MgSO 4, 3 g / L KH 2 PO 4, 7,5 g / l de Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / L NaCl, 1 g / l NH 4 Cl, 4 g / L de glucosa, 50 mg / L de sulfato de kanamicina). Suplemento con Centrum completa de A a zinc para proporcionar vitaminas B y metales traza:. Disolver 1 comprimido en 40 ml de H 2 O con mezcla durante 30 min, centrifugar para eliminar el material insoluble y el sobrenadante estéril filtro naranja Tienda solución madre a 4 ° C en la oscuridad durante hasta 2 semanas y el uso de 4 ml / L en M9.
NOTA: 15 N enriquecido con NH 4 Cl, C-13 glucosa enriquecido u otros precursores de isótopos estables marcados pueden ser incluidos en medio M9 que en esta etapa si se desea. - Inocular un cultivo de 100 ml de arranque recién transformado BL21 E. (DE3) cepa coli en medio M9/Kan. Crecer durante la noche a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
- A la mañana siguiente, comprobar la OD 600 del cultivo iniciador - esto debe estar en el intervalo de 2 o mayor. Diluir el cultivo de 100 ml de arranque en 1 l de volumen total de Centrum medio suplementado M9. Dividido en dos matraces de 2 L deflectores (500 ml de cultivo en cada matraz) y crecen a 37 ° C con agitación a 140 rpm hasta que la DO 600 alcanza 0,6.
- Ajuste la temperatura del agitador a 18 ° C y continuar agitando durante 1 hora, permitiendo que las culturas se enfríe por completo antes de la inducción.
- Tomar una muestra de pre-inducción para el análisis de SDS-PAGE (equivalente de 50 l de un cultivo a una DO de 600 = 1), a continuación, añadir IPTG a una concentración final de 0,1 mM para inducir la expresión de la fusión trpLE-péptido. Continuar creciendo a 18 º C/140 rpm durante la noche (16-20 horas) en la inducción de IPTG.
3. Inclusión Preparación Corporal y Encuadernación matriz de níquel
- La final OD 600 de cultivos de expresión durante la noche en medio mínimo es variable y should ser de entre 2,5 y 5,0. Tomar una muestra para análisis SDS-PAGE (equivalente de 50 l de un cultivo a una DO de 600 = 1) y recoger las células por centrifugación durante 20 min a 5.000 x g.
- Resuspender el sedimento de células de cultivo L 1 en 50 ml de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Las suspensiones celulares se puede almacenar congelado para su posterior procesamiento.
- Lisar las células por sonicación en hielo a potencia máxima durante 1 min y el resto en hielo durante 5 min. Usamos un Sonicator Misonix 3000 (max 600 vatios de salida) con una punta de ½ pulgadas de alta intensidad reemplazable. Repita sonicación / refrigeración durante tres ciclos.
- Recoger el cuerpo de inclusión insoluble (IB) el material por centrifugación durante 15 min a 20.000 xg y descartar el sobrenadante. Una capa suelta y fina de restos de células de color más claro puede ser visible en la parte superior de la densa pellet IB; este puede ser lavado con agua o tampón con agitación suave. Pasos 3,3 y 3,4 se puede repetir para mejorar la pureza de la fracción IB si desirojo. Las muestras de sedimento y el material sobrenadante se deben tomar para el análisis de SDS-PAGE para confirmar trpLE-TM localización fusión a los cuerpos de inclusión.
- Disolver IB pellets en solución de guanidina (6 M de guanidina HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% de Triton X-100, 5 mM β-ME), con 25-50 ml por litro de cultivo procesado. Este paso requiere varias horas con agitación y sonicación suave ocasional.
- Borrar el lisado IB por centrifugación durante 1 hora a 75,000-100,000 xg y 20 ° C. Decantar el sobrenadante y filtrar a través de una membrana de 0,2 micras.
- Combinar el lisado aclarado IB, en un tubo cónico de 50 ml o un recipiente más grande que se puede cerrar de forma segura, con resina de afinidad de níquel que ha sido lavada con agua y se equilibra con solución de guanidina. Usar 3-4 ml de resina se establecieron por litro de cultivo procesado para las fusiones que expresan a un grado similar como trpLE-DAP12TM se muestra aquí (Figura 3, carril 2). Lotes se unen mediante la incubación de la noche a la habitación t emperatura con mezcla suave.
4. En la columna de reticulación oxidativa
- Cargue el lisado IB / níquel suspensión de resina en una columna de desagüe vacío con soporte de lecho poroso, agregando continuamente hasta que todo el volumen fluye. Recoger y dejar a un lado la medición de flujo, que pueden contener proteína no unida fusión.
- Lavar la resina de níquel mediante flujo por gravedad con 5 volúmenes de lecho de solución de urea (8 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl) que contienen 5 mM β-ME.
- Lavar la resina de níquel de nuevo con 5 volúmenes de lecho de solución de urea sin β-ME.
- Lavar la resina de níquel una tercera vez con 5 volúmenes de lecho de solución de urea que se ha complementado con 20 mM CuSO 4 y 2 mM de glutatión oxidado. Después de este lavado, cerrar la salida de la columna y se incuba 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación máxima de enlace disulfuro.
5. TFA Elución y Cuantificación
contenido ">
PRECAUCIÓN: ácido trifluoroacético (TFA) provoca graves quemaduras al entrar en contacto con la piel y los vapores son muy irritantes TFA concentrado debe utilizarse sólo en una campana de humos químicos aprobados con protección para los ojos y guantes que no contengan látex Compruebe la compatibilidad química de todos.. los materiales utilizados, el polipropileno es compatible con todos los pasos de este protocolo.
- Lavar la solución de urea oxidante con 10 volúmenes de lecho de agua y secar el lecho de la columna mediante la aplicación de una línea de vacío a la salida de la columna.
- Cierre la salida de la columna y añadir 1,5 volúmenes de lecho de puro (99-100%) TFA. Se agita la resina de níquel con una pequeña espátula de garantizar una exposición al ácido y se incuba durante 5 min. Abrir la salida de la columna y recoger el eluato ácido, presurizando suavemente con una jeringa o una línea de aire comprimido, si es necesario para expulsar todo el líquido.
- Repita el paso de elución ácida con otros 1,5 volúmenes de lecho de TFA puro. Trabajar rápidamente en este paso para evitar la disolución completa de la beaded matriz de agarosa. El rendimiento de proteína se puede determinar en este punto según la ecuación de Beer-Lambert y el coeficiente de extinción molar teórico de la secuencia trpLE-péptido. Se diluye una muestra del eluato TFA (1:20 a 1:50) en trifluoroetanol (TFE) y medir la absorbancia a 280 nm, utilizando TFA / TFE a la misma dilución como blanco.
6. La digestión con CNBr
ADVERTENCIA: El bromuro de cianógeno (CNBr) es extremadamente tóxico y debe ser manejado sólo en una campana de humos químicos aprobado. PPE incluyendo gafas de seguridad, bata de laboratorio y guantes de látex no son absolutamente necesarios. CNBr es reactivo a la humedad y debe estar a temperatura ambiente antes de abrirse. Póngase en contacto con su oficina de seguridad institucional para obtener instrucciones sobre la neutralización / enajenación de CNBr contaminados con soluciones y materiales.
- Diluir el eluido ácido a la concentración de TFA 80% final de la adición gota a gota de agua mientras se mezcla suavemente. Si se forma un precipitado, unadd atrás un pequeño volumen (0,5 a 1 ml) de TFA puro hasta que se clarifique la solución, a continuación, re-correcta a 80% con agua. Tomar un 5 l pre-digestión de la muestra para el análisis de SDS-PAGE, la congelación en nitrógeno líquido y liofilizar la muestra inmediatamente.
- Añadir cristales CNBr a aproximadamente 0,2 g / ml, teniendo cuidado para pesar el producto químico tóxico de forma segura en cerradas, tubos previamente pesados o usando un equilibrio dentro de la campana química. Mezclar suavemente hasta su completa disolución. Enjuague y sellar el recipiente de reacción en atmósfera de gas inerte (nitrógeno o argón corriente) e incubar 3-4 horas a temperatura ambiente, protegido de la luz.
- Tomar un 5 l post-digestión de la muestra para el análisis por SDS-PAGE y congelar y liofilizar inmediatamente. Transferir la reacción de digestión a un casete de diálisis de celulosa regenerada o tubería (acetato de celulosa se disuelve en ácido concentrado) con un corte de peso molecular de 3,5 kDa o menos, de acuerdo con el tamaño del complejo péptido esperado. Dializar durante toda la noche a 4 L de agua en lacampana química para reducir la concentración de TFA y descomponer cualquier CNBr sin reaccionar. Deje espacio en el casete de diálisis o las tuberías para un aumento significativo en el volumen (tanto como de dos a tres veces) durante la diálisis durante la noche.
- Quitar la solución de reacción dializada con precipitado suspendido de la casete de diálisis o los tubos (la mayor parte de la proteína se precipita cuando la concentración de TFA se reduce) y transferir la suspensión a tubos de 50 ml cónicos. Congelar y liofilizar para eliminar el agua y trazas de CNBr / TFA. Este paso es probable que requieren varios días.
PRECAUCIÓN: Tanto la reacción dializada resumen y el agua de diálisis deben seguir siendo tratados como tóxicos y manipulados / desecharse con las precauciones adecuadas. - Muestras de cultivos procedentes de las etapas de pre-inducción y la cosecha, por cuerpos de inclusión sobrenadante y el sedimento, el eluido TFA y digerido con CNBr material puede ser analizado mediante SDS-PAGE. Preparar muestras por calentamiento a 95 ° C en Invitrogen NuPAGE LDS sample tampón. Eluato TFA y muestras de digerir deben estar preparados tanto en condiciones reductoras y no reductoras para facilitar la identificación del producto y la evaluación de la reticulación oxidativa.
- Separar las muestras en un 12% NuPAGE bis-tris gel de acrilamida prefabricado utilizando MES-SDS funcionamiento de amortiguación para una resolución óptima de los productos más pequeños digerir.
7. HPLC de fase inversa Purificación de disulfuro reticulados complejos de péptidos
- Disolver hasta 100 mg de liofilizado productos resumidos en 2-3 ml de ácido fórmico puro y carga en un a escala preparativa (21,2 x 150 mm) de Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT columna de disolvente A (típicamente acetonitrilo 10-20% o 5 -10% de isopropanol en agua con 0,1% de TFA).
- La elución de los productos de digestión en un gradiente de disolvente B (acetonitrilo o isopropanol con 0,1% TFA) durante al menos 5 volúmenes de columna. Véase la discusión para obtener sugerencias sobre la selección de las condiciones óptimas para el gradiente de secuencias de péptidos diferentes.
- Tomar50-100 muestras mu l de cada fracción de HPLC para el análisis de SDS-PAGE y congelar y liofilizar inmediatamente. Eliminación de los disolventes de HPLC es rápido y debe ser completa en 1-2 horas.
- Preparar muestras liofilizadas de HPLC para SDS-PAGE por calentamiento a 95 ° C en tampón de muestra de Invitrogen NuPAGE LDS sin agente reductor. Enfriar y se dividió cada muestra uniformemente en 2 tubos de microcentrífuga, añadiendo DTT 100 mM a una de ellas y brevemente re-calentamiento.
- Se separan las muestras de HPLC reducidas y no reducidas en un 12% NuPAGE Bis-Tris gel de acrilamida premoldeados con MES-SDS funcionamiento de amortiguación como anteriormente. Pequeños péptidos hidrofóbicos, a menudo no toman Coomassie bien y no se puede ejecutar en sus pesos moleculares esperados. Sin embargo, la comparación de muestras reducidas y no reducidas debe facilitar la identificación de los productos peptídicos reticulados y de evaluación de la pureza.
- Analizar los candidatos que contienen fracciones de péptidos por láser asistida por matriz de desorción ionización tiempo de vuelo (MALDI-AF) espectrometría de masas (ver Discusión) para identificar las especies de interés y confirme su masa esperada.
- Combinar, congelar y liofilizar las fracciones de HPLC que contienen la pura, reticulado TM complejo de péptido y tener un peso en seco del producto final para determinar el rendimiento. Las fracciones con contenido de isopropanol alta no puede permanecer congelado. Si fracciones de péptidos secar hasta una película en lugar de un producto liofilizado esponjoso, volver a disolver la película completamente en un pequeño volumen de puro hexafluoroisopropanol (HFIP), congelar y liofilizar de nuevo. El producto HFIP tratados debería ser un cono pequeño y blanco que es fácil de punta a cabo y se pesa.