Se describe aquí la operación de un dispositivo de microfluidos que permite imágenes microscópicas continua y de alta resolución de las células de levadura en ciernes individuales durante su completa replicativa y / o cronológico vida útil.
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Artículo de método
Continua observación microscópica de alta resolución de replicativa envejecimiento en la levadura en ciernes
En este artículo
Resumen
Resumen
Se demuestra el uso de una configuración sencilla de microfluidos, en el que las células de levadura en ciernes individuales pueden ser rastreados a lo largo de toda su vida útil. El chip de microfluidos explota la diferencia de tamaño entre las células madre y su hija con una gran variedad de micropads. Tras la carga, las células se encuentran atrapados debajo de estas micropads, porque la distancia entre la micropad y cubierta de vidrio es similar al diámetro de una célula de levadura (3-4 micras). Después de que el procedimiento de carga, medio de cultivo se vacía continuamente a través del chip, que no sólo crea un ambiente constante y definida a lo largo de todo el experimento, pero también vaciados de las células hijas emergentes, que no sean retenidos debajo de las pastillas debido a su tamaño más pequeño. La configuración conserva las células madre manera tan eficiente que en un solo experimento de hasta 50 células individuales pueden ser controlados de una manera completamente automatizada durante 5 días o, si es necesario, ya. Además, las excelentes propiedades ópticas del chip permiten altoResolución de imagen de células durante todo el proceso de envejecimiento.
Introducción
Ciernes levadura es un organismo modelo importante para la investigación del envejecimiento 1. Hasta recientemente, el estudio de envejecimiento replicativa en células de levadura era un proceso laborioso que requiere un método de disección, en la que cada brote fue retirado manualmente de la célula madre 2,3. Para solucionar este problema, hemos presentado recientemente una nueva configuración de microfluidos capaz de rastrear las células madre individuales a lo largo de toda su vida útil 4.
En nuestro chip de microfluidos, células de levadura son atrapados bajo micropads suaves elastómero a base de (véase la Figura 1). Un flujo continuo de medio de lava células hijas recién formadas y proporciona a las células con nutrientes frescos. En un experimento, de hasta 50 células madre pueden ser controlados de forma totalmente automática durante toda su vida replicativa. Debido a las excelentes propiedades ópticas del chip de microfluidos, es posible controlar simultáneamente diferentes aspectos de la biología celular de la levadura (por ejemplo, por el uso de proteínas fluorescentes).
En comparación con el método de disección clásica, la configuración de microfluidos proporciona ventajas sustanciales. Se asegura un entorno definido y constante durante todo el experimento de envejecimiento. No requiere de equipo especializado costoso y se puede ejecutar en cualquier microscopio equipado con enfoque automático y capacidades de lapso de tiempo, así como de control de temperatura para el cultivo celular. La producción y el funcionamiento de los chips de microfluidos se pueden aprender en unos pocos días. Además, las células se pueden cargar directamente de un cultivo en crecimiento exponencial, una ventaja sobre otro método de microfluidos recientemente publicado 5, que requiere la biotinilación de las células madre. Combinado con una alta resolución de imagen, el método aquí descrito se puede utilizar para medir los cambios graduales en la morfología celular, expresión de la proteína y la localización de levadura durante el envejecimiento en una forma sin precedentes. La capacidad paraseguimiento a largo plazo de las células individuales también ofrece posibilidades únicas para estudios del ciclo celular de levadura.
un Este método ha sido optimizado recientemente para eliminar la biotinilación del protocolo 16, que se publicó mientras que este manuscrito estaba en revisión.
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Protocolo
1. Producción y Elaboración de una oblea de silicio del molde
Chips de microfluidos se crean a partir de un molde de obleas de silicio producido por la litografía blanda. Estas obleas se pueden reutilizar muchas veces para producir chips de microfluidos. Es aconsejable que la producción de una oblea respectiva se lleva a cabo por un grupo especializado en la microfluídica 6.
La oblea se hace en un proceso de fotolitografía en dos etapas utilizando dos capas diferentes de material fotorresistente negativo, SU-8 7. La capa inferior se utiliza para generar la zona de atrapamiento celular (SU-8 2002; altura de 3-4 micras), mientras que los canales se hacen con la capa superior (SU-8 2010; altura de 10 micras). Una impresión del proceso de producción de obleas se puede encontrar en Huang et al 8. Los dibujos de los chips de microfluidos se pueden obtener de los autores, así como asesoramiento sobre cómo obtener una oblea respectiva.
- Una vez que se obtiene la oblea, cortar una pieza de Tough-Tag into tiras delgadas de aproximadamente 0,5 mm por 3 mm con un bisturí y colocar con cuidado sobre la oblea ligeramente en la parte superior de la estructura del canal entre los canales de entrada y la matriz de micropad (Figura 2A). Esto dará lugar a la formación de un gran canal adicional en cada chip, que no sólo se utiliza durante la carga de las células, pero también es importante para el funcionamiento estable del dispositivo de microfluidos.
- Cubrir la placa de Petri de vidrio con una doble capa de papel de aluminio y poner la oblea en la placa de Petri. El papel de aluminio evitará que se ejecute en PDMS entre la oblea y la placa de Petri. Si PDMS hace colarse entre la oblea y la placa de Petri de vidrio, la oblea será fijado de forma permanente en la placa de Petri. A pesar de la oblea es aún utilizable, no será posible reemplazar la placa de Petri de vidrio en caso de rotura y el PDMS tendrá que ser cortada después.
2. La producción de chips de microfluidos
- Coloque un plástico vacíavaso en la balanza y tarar la balanza. Verter 40 g de PDMS de base en el vaso de plástico (para un cm de diámetro de cristal placa de Petri 12). Añadir agente de curado PDMS con una pipeta desechable en relación p / w de 1:10, es decir, alrededor de 4 ml.
- Mezclar el PDMS y agente de curado a fondo durante varios minutos. Esto se puede hacer con la pipeta de plástico desechable que se utilizó para pipetear el agente de curado. Es importante que la mezcla se mezcla bien antes de verterla en la parte superior de la oblea. Pobre mezcla hará que parte del PDMS no polimeriza.
- Verter el PDMS en la parte superior de la oblea en la placa de Petri de vidrio.
- La mezcla de PDMS con el agente de curado dará lugar a la formación de burbujas en la mezcla de PDMS. Estas burbujas deben ser eliminados antes de que el PDMS se polimeriza. El PDMS puede ser desgasificado después de verter en la parte superior de la oblea mediante la colocación de la placa de Petri en un desecador conectado a una bomba de vacío. Con esta configuración, se tarda unos 30 minutos para eliminar todas las burbujas de la mezcla.
- Polimerizar ªe PDMS mediante la colocación de la placa de Petri con la oblea en la parte superior de una placa caliente a 120 ° C durante 1 hora y luego a 65 ° C durante otra hora.
- Retirar el papel de aluminio junto con la oblea y polimerizado PDMS de la placa de Petri de vidrio. Despegue el papel de aluminio y la capa residual fina de polimerizado de PDMS de la parte posterior de la oblea. La capa de PDMS en la parte superior de la oblea a continuación, se puede separar de la oblea levantándolo cuidadosamente.
- Coloque la capa de PDMS al revés (con los canales hacia arriba) en el banco y cortar los diseños de chip único impreso en el PDMS cuidadosamente con un escalpelo. Trate de retener aproximadamente 3 mm de PDMS alrededor de los bordes de los canales para mejorar el agarre de la viruta para la cubierta de vidrio más adelante.
- Haga agujeros en el PDMS en los extremos del canal de entrada, salida y lateral (Figura 2A) presionando un trozo Luer Calibre 20 todo el camino a través del PDMS en forma recta.
Asegúrese de que el chip de PDMStodavía está acostado boca abajo en el banco mientras perforación de los agujeros. Esto evita PDMS se pegue a la parte interior del canal, lo que podría causar el bloqueo del canal.
- Después de perforar cada agujero, quite la columna de PDMS en el talón de Luer con pinzas antes de tirar la colilla de nuevo. La columna PDMS lo contrario podría quedarse atrás y bloquear el agujero sólo puñetazos.
- Limpiar las superficies del chip de partículas de polvo residual y PDMS mediante la colocación de cinta adhesiva sobre el mismo y retirar inmediatamente la cinta de nuevo. Del mismo modo limpiar el vidrio de cubierta a la que se une el chip.
- Coloque el chip limpiado y cubierta de vidrio debajo de la lámpara de UV de la sobremesa UV-ozono Cleaner. Los lados que necesitan ser unidas entre sí deben hacer frente a la lámpara.
- Exponer el PDMS y cubierta de cristal de la luz UV de 6-8 min y directamente después poner el chip en la cubierta de vidrio mediante la colocación de las superficies expuestas en la parte superior de uno al otro.
- Golpee suavemente alrededor de los lados del chippara promover la unión del PDMS a la cubierta de vidrio y para eliminar cualquier burbuja de aire. No toque en la parte superior de la estructura del canal, ya que podría provocar que los micropads quedar atado a la cubierta de vidrio también.
- Coloque la configuración de microfluidos recién hecho en una placa caliente a 100 ° C durante 60 min. Prueba de la fuerza de la unión entre el vidrio de cubierta y el chip de PDMS tratando de levantar los bordes del chip PDMS ligeramente. Cuando el bloque PDMS no puede ser levantada de la superficie del vidrio, la unión es exitosa y el chip está listo para su uso.
3. Preparación de la viruta para la célula de carga
El fallo de un dispositivo de microfluidos potencialmente puede causar una fuga de medio en el microscopio. Para evitar esto, es de asesoramiento para utilizar un soporte de metal y / o sellar los lados del chip donde el PDMS se encuentra con el vidrio con esmalte de uñas o pegamento epoxi. Esto evita la fuga de medio en el caso de que el chip de PDMS no está unido suficientemente bien como para la cubierta de vidrio. También la tuberíaconexiones pueden ser asegurados alrededor de los puntos de inserción en una manera similar para evitar la fuga de medio. Un sensor de agua de fabricación casera que se desconecta la bomba de jeringa en caso de fuga se puede utilizar como una medida de seguridad adicional. Dibujos del soporte de metal especialmente diseñado para el chip de microfluidos pueden obtenerse a partir de los autores.
- Coloque el chip de microfluidos en el soporte de metal, con gel de silicona entre el vidrio del chip y las partes metálicas de la titular para crear un sello impermeable. Atornille las tuercas con cuidado, para no romper el vidrio.
- Conectar tubos delgados (5-15 cm de largo) a la canal lateral y el canal de salida del chip. El uso de pinzas hace que sea más fácil de insertar el tubo en los agujeros perforados.
- Llenar una jeringa de 50 ml Luer-Lok con medio de cultivo, eliminar el aire de la jeringa y conectar secuencialmente a un filtro de jeringa, un talón de Luer 20 de manómetro, un tubo corto y grueso (ca. 2 cm de largo) y un tubo delgado. Asegúrese de que la tina finae es el tiempo suficiente para abarcar la distancia entre la bomba de jeringa y la platina del microscopio.
- Coloque la jeringa en la bomba de jeringa, avance rápido de la bomba hasta que el tubo delgado está completamente lleno con el medio.
- Empuje el tubo delgado conectado a la jeringa en el canal de entrada del chip y dejar que el flujo del medio a través del chip a 10 l / min (Figura 2B). Recoger el medio dejando el chip (por ejemplo, en una placa de Petri). El medio se ejecutará a cabo a través del canal lateral debido a la diferencia de resistencia entre la Tough-Tag hace grande canal lateral y el canal de salida.
- Coloque el chip en la platina del microscopio y ajustar el enfoque del microscopio en las almohadillas.
Se prefiere el uso de objetivos de inmersión en aceite sobre la de objetivos de inmersión en agua porque el aceite no se seque durante el tiempo-curso del experimento.
Dependiendo del microscopio, podría haber problemas con la retención de fOCU en las primeras horas del experimento. Por lo tanto, es aconsejable dejar el chip durante una a dos horas en la platina del microscopio por lo que puede establecerse antes de cargar las células y de comenzar el experimento.
4. La carga de las células de levadura en el chip de microfluidos
- Conecte un ml jeringa con punta Luer 5 a un talón de Luer Calibre 20 y un tubo de espesor (alrededor de 3 cm).
- Tomar una muestra del cultivo de células para ser cargado en el chip.
El recuento de células preferida para la carga es entre 1-5 x 10 6 células por ml. Los cultivos con recuentos superiores deben diluirse antes de la carga. Cuando el cultivo de células en YPD, la eficiencia de carga de las células se pueden mejorar muchas veces si las células se lavan primero con y se resuspendieron en medio mínimo que contiene un porcentaje de glucosa similares antes de la carga. Durante el funcionamiento del chip, medio YPD nuevo puede ser utilizado con seguridad.
- Cargar aproximadamente 1 ml de la suspensión celular en the jeringa y eliminar todo el aire de la jeringa.
- Disminución de la velocidad de flujo de la bomba de jeringa a 0,5 l / min. El flujo de baja y continua aplicada por la bomba de jeringa durante la carga (en el paso 4.5) empujará las células no unidas a cabo a través del canal lateral (Figura 2C).
- Conectar la jeringa que contiene la suspensión de células en el tubo del canal de salida. Cargar las células presionando sobre el émbolo de la jeringa suavemente. Observar las células que entran y resolver bajo las micropads través del ocular oa través de la pantalla del ordenador.
- Mantenga la presión sobre el émbolo hasta que suficientes células se asientan debajo de las almohadillas. La carga óptima es de 1-3 células por pad. Como las células se asientan por debajo de las almohadillas al azar, es bastante común que algunas pastillas no contienen células y otras almohadillas están completamente llenos de células.
- Desconexión de la jeringa utilizada para la carga de las células y el tubo grueso conectado a la misma desde el tubo fino del canal de salida, lavar el lado channel durante un par de minutos a mayores velocidades de flujo (10 l / min) para eliminar las burbujas de aire y / o células que aún no ha salido el chip (Figura 2B). Si las células no se eliminan del canal lateral, que pueden comenzar a crecer en el canal lateral y interferir con el experimento más adelante.
- Ponga el flujo de la bomba de jeringa de vuelta a 0,5 l / min y cerrar el canal lateral a la salida mediante la conexión a un tubo de espesor (alrededor de 5 cm de largo) que contiene un tapón de catéter en su extremo (Figura 2D).
- Aumentar el flujo a una velocidad de flujo final de 1-5 l / min. Las velocidades de flujo pueden variar dependiendo del medio y la cepa de levadura.
- Iniciar una película con la configuración de microscopio y cámara adecuados para el objetivo del experimento. Asegúrese de que la velocidad de la platina del microscopio se ajusta a una velocidad tan baja que el petróleo puede seguir. Para la determinación de replicativo, celdas de imagen cada 10 min. Para proteger las células de las cantidades de luz ultravioleta emitida por el halógenolámpara, que se utiliza durante la adquisición de DIC, es recomendable colocar un filtro UV adicional en la trayectoria de la luz. Cuando se utiliza la microscopía de fluorescencia, se prefiere a la imagen de las células con menos frecuencia (por ejemplo, cada 20 minutos) para evitar efectos fototóxicas. El experimento se completa cuando todas las células cargadas en el inicio del experimento están muertos, que en condiciones normales toma hasta 5 días. Se recomienda visitar periódicamente el enfoque de las imágenes durante el experimento y si es necesario ajustarlo.
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Resultados
En este protocolo, las células se cargan en el chip de microfluidos directamente del cultivo exponencial media. Para determinar si la distribución de la edad de las células atrapadas en el chip de microfluidos es similar a la del cultivo antes de la carga, las células se tiñeron con aglutinina de trigo conjugada con FITC (WGA-FITC) para visualizar las cicatrices del brote. Como puede verse en la Figura 3, el atrapamiento de células bajo las micropads del chip de microfluidos no está sesgada a las célula...
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Discusión
El método de microfluidos descrito aquí es una nueva herramienta importante en la investigación del envejecimiento, ya que permite la generación sencilla y automatizada de levadura replicación de datos de vida útil en combinación con imágenes continuas de alta resolución. Estos atributos son importantes mejoras con respecto a las posibilidades experimentales del método de disección clásica, sin embargo, hay algunas limitaciones del método que necesita ser tenido en cuenta.
Tenga en cuenta qu...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a Laura Schippers para escribir las primeras versiones del protocolo de carga celular y Marcus de Goffau y Guille Zampar atinar morfologías mitocondriales.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| fuertes | |||
| elastómero >DC fuerte Sylgard 184 | Mavom bv | 1060040 | Este paquete contiene base de PDMS y agente de curado de PDMS. |
| Placas de Petri de vidrio 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cubreobjetos 22x40 mm | CBN Labproveedores BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Papel | |||
| Vaso | |||
| Pipeta serológica 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Cinta adhesiva | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone (siliconas GE Bayer) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| Tubo de microdiámetro de PTFE, 0,012" de diámetro interno x 0,030" de diámetro exterior | Cole Parmer | EW-06417-11 | Denominado tubo delgado |
| Tubo de microdiámetro Tygon, 0,030" de diámetro interno x 0,090" de diámetro exterior | Cole Parmer | EW-06418-03 | Denominado tubo grueso |
| Bisturí VWR | International | 233-5334 | |
| Jeringas Luer-Lok de 50 ml | BD 300137 | ||
| Jeringas de 5 ml, punta Luer | Pinzas VWR International | 613-1599 | |
| VWR International | 232-2132 | ||
| Calibre 20 Puntas Luer | Instech Solomon | LS20 | |
| Filtros de jeringa (tamaño de poro 0,20 μ m) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Tapón de catéter de acero inoxidable, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Placas de Petri | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Limpiador de ozono UV de sobremesa | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 molde maestro de silicio (oblea) | Hecho a sí mismo; Para más detalles, póngase en contacto con el autor para correspondencia | ||
| Balanza | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Bomba de vacío | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desecador | VWR International | 467-2115 | |
| Placa calefactora | VWR International | 460-3267 | |
| Opcional: Soporte metálico para cubreobjetos (22x40 mm) | Casero; Para más detalles, póngase en contacto con el autor para correspondencia | ||
| (Fluorescencia) Microscopio con objetivo de 60x, enfoque automático, capacidades de lapso de tiempo y, preferiblemente, una platina automatizada (control XY motorizado) | Nikon | Eclipse Ti-E |
Referencias
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209(2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297(2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275(2012).
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Reimpresiones y permisos
