Continua observación microscópica de alta resolución de replicativa envejecimiento en la levadura en ciernes

Summary

Se describe aquí la operación de un dispositivo de microfluidos que permite imágenes microscópicas continua y de alta resolución de las células de levadura en ciernes individuales durante su completa replicativa y / o cronológico vida útil.

Abstract

Se demuestra el uso de una configuración sencilla de microfluidos, en el que las células de levadura en ciernes individuales pueden ser rastreados a lo largo de toda su vida útil. El chip de microfluidos explota la diferencia de tamaño entre las células madre y su hija con una gran variedad de micropads. Tras la carga, las células se encuentran atrapados debajo de estas micropads, porque la distancia entre la micropad y cubierta de vidrio es similar al diámetro de una célula de levadura (3-4 micras). Después de que el procedimiento de carga, medio de cultivo se vacía continuamente a través del chip, que no sólo crea un ambiente constante y definida a lo largo de todo el experimento, pero también vaciados de las células hijas emergentes, que no sean retenidos debajo de las pastillas debido a su tamaño más pequeño. La configuración conserva las células madre manera tan eficiente que en un solo experimento de hasta 50 células individuales pueden ser controlados de una manera completamente automatizada durante 5 días o, si es necesario, ya. Además, las excelentes propiedades ópticas del chip permiten altoResolución de imagen de células durante todo el proceso de envejecimiento.

Introduction

Ciernes levadura es un organismo modelo importante para la investigación del envejecimiento ^1. Hasta recientemente, el estudio de envejecimiento replicativa en células de levadura era un proceso laborioso que requiere un método de disección, en la que cada brote fue retirado manualmente de la célula madre ^2,3. Para solucionar este problema, hemos presentado recientemente una nueva configuración de microfluidos capaz de rastrear las células madre individuales a lo largo de toda su vida útil ^4.

En nuestro chip de microfluidos, células de levadura son atrapados bajo micropads suaves elastómero a base de (véas....

Protocol

1. Producción y Elaboración de una oblea de silicio del molde

Chips de microfluidos se crean a partir de un molde de obleas de silicio producido por la litografía blanda. Estas obleas se pueden reutilizar muchas veces para producir chips de microfluidos. Es aconsejable que la producción de una oblea respectiva se lleva a cabo por un grupo especializado en la microfluídica ^6.

La oblea se hace en un proceso de fotolitografía en dos etapas utilizando dos capas diferentes de material fotorresistente negativo, SU-8 ^7. La capa inferior se utiliza para generar la zona de atrapamiento celular (SU-8....

Results

En este protocolo, las células se cargan en el chip de microfluidos directamente del cultivo exponencial media. Para determinar si la distribución de la edad de las células atrapadas en el chip de microfluidos es similar a la del cultivo antes de la carga, las células se tiñeron con aglutinina de trigo conjugada con FITC (WGA-FITC) para visualizar las cicatrices del brote. Como puede verse en la Figura 3, el atrapamiento de células bajo las micropads del chip de microfluidos no está sesgada a las célula.......

Discussion

El método de microfluidos descrito aquí es una nueva herramienta importante en la investigación del envejecimiento, ya que permite la generación sencilla y automatizada de levadura replicación de datos de vida útil en combinación con imágenes continuas de alta resolución. Estos atributos son importantes mejoras con respecto a las posibilidades experimentales del método de disección clásica, sin embargo, hay algunas limitaciones del método que necesita ser tenido en cuenta.

Tenga en cuenta qu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
fuertes
elastómero >DC fuerte Sylgard 184	Mavom bv	1060040	Este paquete contiene base de PDMS y agente de curado de PDMS.
Placas de Petri de vidrio 120/20 mm	VWR International	391-2850
Cubreobjetos 22x40 mm	CBN Labproveedores BV	190002240
Tough-Tags	Sigma-Aldrich	Z359106
Papel
Vaso
Pipeta serológica 5 ml	VWR International	612-1245
Cinta adhesiva	VWR International	819-1460
Baysilone (siliconas GE Bayer)	Sigma-Aldrich	85403-1EA
Tubo de microdiámetro de PTFE, 0,012" de diámetro interno x 0,030" de diámetro exterior	Cole Parmer	EW-06417-11	Denominado tubo delgado
Tubo de microdiámetro Tygon, 0,030" de diámetro interno x 0,090" de diámetro exterior	Cole Parmer	EW-06418-03	Denominado tubo grueso
Bisturí VWR	International	233-5334
Jeringas Luer-Lok de 50 ml	BD 300137
Jeringas de 5 ml, punta Luer	Pinzas VWR International	613-1599
	VWR International	232-2132
Calibre 20 Puntas Luer	Instech Solomon	LS20
Filtros de jeringa (tamaño de poro 0,20 μ m)	Sigma-Aldrich	16534K
Tapón de catéter de acero inoxidable, 20 ga x12 mm	Instech Solomon	SP20/12
Placas de Petri	VWR International	391-0892
EQUIPMENT
Limpiador de ozono UV de sobremesa	NOVA Scan	PSD-UVT
Harvard Pump 11 Elite	Harvard Apparatus	70-4505
SU-8 molde maestro de silicio (oblea)			Hecho a sí mismo; Para más detalles, póngase en contacto con el autor para correspondencia
Balanza	Sartorius corporation	ED4202S
Bomba de vacío	KNF Neuberger	N022 AN.18
Desecador	VWR International	467-2115
Placa calefactora	VWR International	460-3267
Opcional: Soporte metálico para cubreobjetos (22x40 mm)			Casero; Para más detalles, póngase en contacto con el autor para correspondencia
(Fluorescencia) Microscopio con objetivo de 60x, enfoque automático, capacidades de lapso de tiempo y, preferiblemente, una platina automatizada (control XY motorizado)	Nikon	Eclipse Ti-E