Aislamiento y grabaciones Kv Canal murinos en miocitos auriculares y ventriculares

Resumen

Kv canal disfunción se asocia con arritmias cardíacas. Con el fin de estudiar los mecanismos moleculares que conducen a tales arritmias que utilizan un protocolo sistemático para el aislamiento de cardiomiocitos auriculares y ventriculares de Kv de canal ratones knockout auxiliares de subunidades. Cardiomiocitos aislados a continuación, puede ser utilizado inmediatamente para estudios electrofisiológicos celulares, bioquímicos o inmunofluorescencia (IF) ensayos.

Resumen

KCNE genes codifican para una pequeña familia de canales Kv subunidades auxiliares que forman complejos con heteroméricos Kv canal subunidades alfa para modificar sus propiedades funcionales. Las mutaciones en los genes de KCNE se han encontrado en pacientes con arritmias cardiacas tales como el síndrome de QT largo y / o la fibrilación auricular. Sin embargo, la fisiopatología precisa molecular que conduce a estas enfermedades sigue siendo difícil de alcanzar. En estudios previos de las propiedades electrofisiológicas de la enfermedad que causa mutaciones en estos genes han sido estudiados principalmente en sistemas de expresión heterólogos y no podemos estar seguros de si los efectos reportados directamente se puede traducir en cardiomiocitos nativos. En nuestro laboratorio, por lo tanto, utilizar un enfoque diferente. Nuestros estudiar los efectos de la supresión de genes KCNE en cardiomiocitos aislados de los ratones knockout de electrofisiología celular - una técnica única que se describe en este número de la Revista de experimentos visualizados. Los corazones de la geneticaLLY diseñaron ratones KCNE se extirparon rápidamente y se montaron en un aparato Langendorff por canulación aórtica. Gratis Ca ^{2 +} en el miocardio está obligado por EGTA, y la disociación de los miocitos cardíacos se consigue después de una perfusión retrógrada de las arterias coronarias con un especializado bajo Ca ^{2 +} que contiene tampón de colagenasa. Atria, la pared libre del ventrículo derecho y el ventrículo izquierdo se puede separar por técnicas de microcirugía. El calcio se añade entonces lentamente de nuevo a cardiomiocitos aislados en un paso múltiple que comprende procedimiento de lavado. Cardiomiocitos auriculares y ventriculares de apariencia sana sin contracciones espontáneas son entonces inmediatamente se sometió a análisis electrofisiológicos mediante la técnica de patch clamp o otros análisis bioquímicos dentro de las primeras 6 horas después del aislamiento.

Protocolo

1. Animal Anestesia y sustracción de órganos

1. Anestesiar el ratón por vía intraperitoneal (ip) de inyección de ketamina (200 mg / kg de peso corporal) y xilazina (20 mg / kg BW).
2. Para anticoagular inyectar ip 250 UI de heparina para evitar la formación de trombos y coágulos sanguíneos.
3. Esperar hasta que la narcosis se alcanza, que se caracteriza por arreflexia. Para comprobar si hay prueba de reflejo arreflexia corneal tocando suavemente la córnea o el reflejo vuelo de prueba de pellizco cola.
4. Transferir el ratón sobre mesa de operaciones y fijarlo en posición supina.
5. Incisión de la piel y la pared abdominal por debajo del apéndice xifoides y realizar una toracotomía clamshell: Extender el corte a lo largo de ambos lados del arco costal y posteriormente cortar las costillas en la línea axilar media, desviar hacia arriba la caja torácica.
6. Abra pericardio, localizar los grandes vasos. Presione suavemente caudal corazón para mostrar mejor la aorta. Sujete la aorta utilizando fórceps.
7. Colocar el corazón en la concavidad de un par de s cissors y diseccionar todos los barcos que conectan con un solo corte. Asegúrese de preservar una parte suficientemente grande de la aorta ascendente para la canulación de Langendorff.
8. Transferir corazón extirpados inmediatamente a una placa de Petri llena de hielo frío y pre-oxigenada solución 1 (para soluciones, véase la Tabla 1).

2. Preparación de perfusión del corazón y Langendorff

1. Canular la aorta con una cánula de acero 1.8F. Asegúrese de evitar una embolia gaseosa.
2. Fije aorta en la cánula con una sutura quirúrgica y coronarias ras con 1 ml de solución 1.
3. Conectar la cánula con un aparato Langendorff.
4. Asegúrese de que el tiempo de toracotomía de la canulación Langendorff no exceda de 120 segundos para evitar extendida por isquemia / reperfusión en el miocardio.
5. Corazón perfundir con 10 ml de Ca ^{2 +} libre solución 2 (4 ml / min).
6. Corazón perfundir con solución de colagenasa 3 de 8 min (4 ml / min).

le "> 3. Microsurgical disociación de Cardiac Cámaras

1. Transferencia de corazón en una pre-calentado 100-mm placa de Petri que contiene bajo Ca ^{2 +} solución 4.
2. Retire con cuidado la aorta y otros no-tejido cardíaco con unas tijeras y lo descarta.
3. Aurículas y los ventrículos separados y continuar con cada cámara por separado. Mantener las células sumergidas en solución 4. Utilizar volúmenes pequeños (menos de 5 ml).

4. Disociación Además de los cardiomiocitos

1. Cardiomiocitos auriculares:
   1. Para individualizar miocitos auriculares transferir las aurículas en un aparte precalentado placa de cultivo de 100 mm y disociar el tejido a través de él con cuidado separando con unas pinzas finas. Asegurar una disociación casi completa del tejido.
   2. Usar una pipeta de 1 ml con una vista ampliada pulida al fuego punta de pipeta de plástico para suspender las células en 1 ml de solución de 5 por 5 min.
   3. Se separan las células de los desechos mediante el uso de un filtro celular (200 micras de malla).
   4. Añadir 5 ml de solución 5 a la suspensión de células y se centrifuga durante 2 min a 16 xg a la temperatura ambiente.
   5. Los siguientes pasos se hacen funcionar bajo una campana de cultivo de células. Eliminar el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 5 ml de solución 6.
   6. Después de la sedimentación por gravedad durante 10 min en un tubo de 15 ml, centrifugar durante 1 min a 16 x g a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante. Volver a suspender las células en función de su cantidad en 1-5 ml de solución 6.
2. Cardiomiocitos ventriculares:
   1. Diseccionar la región ventricular izquierda de interés con unas pinzas finas en 5 ml de solución 4.
   2. Suspender las células pipeteando suavemente hasta que la mayoría de las células se separan. Transferir la solución de células después de la filtración (200 micras de malla) en un tubo de 50 ml, añadir un volumen de 25 ml.
   3. Centrifugar durante 2 min a 16 xg a la temperatura ambiente.
   4. Los siguientes pasos se hacen funcionar bajo una campana de cultivo de células. Remover el sobrenadante, resuspender el precipitado en 25 ml desolución de 6 y permitir la sedimentación de las células durante 10 min.
   5. Contar las células y eliminar el sobrenadante, añadir 25 a 50 ml de solución 6 en las células.

5. Preparación de cardiomiocitos de Electrofisiología Celular, Bioquímica o si los estudios

1. Para los estudios de electrofisiología, mantener los miocitos en solución en un tubo de 6 ml y 50 inhiben la sedimentación.
2. Para los estudios bioquímicos, formación de imágenes por ejemplo, calcio, miocitos placa sobre laminina plato recubierto cultivo de células (concentración final 20 mg / ml de laminina en PBS).
3. Para la tinción de inmunofluorescencia preparar un cultivo de células placa plato con cubreobjetos de vidrio y recubierto con una solución de laminina (concentración final 50 mg / ml de laminina en PBS).
   1. Retire la solución antes de miocitos galvanoplastia. Placa de las células y controlar la densidad de las células utilizando un microscopio.
   2. Deje que los miocitos se adhieren a cubreobjetos durante 1 hora a 37 ° C en 2% de CO _2, eliminar la solucióny comenzar inmediatamente con un protocolo de tinción procedimiento estándar.
   3. Incubar con fijador, por ejemplo, 4% de PFA en PBS (pH 7,5) durante 10 min a temperatura ambiente y sigue con tres pasos de lavado con PBS durante 5 min cada uno.
   4. Para permeabilizar las células y de inhibir la unión de anticuerpos inespecíficos incubar los miocitos con 10% de suero, 0,3% de Triton, 0,2% de BSA en PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
   5. Incubar con el anticuerpo primario durante 1 hora a 37 ° C y se lavan como se ha descrito antes.
   6. Se incuba con el anticuerpo secundario durante 1 hr a temperatura ambiente. Para contrateñir los núcleos y α-actinina uso DAPI y phalloidin fluorocromo conjugado (Alexa Fluor 488, Invitrogen).
   7. Después del lavado, transferir la cubierta de cristal se desliza con cuidado en silano portaobjetos tratados y las células incrustar en medio de fluorescencia de montaje.

6. Electrofisiología Celular

1. Realizar Plenario de células patch-clamp grabaciones en frecuenciashly aislado cardiomiocitos auriculares y ventriculares a temperatura ambiente.
2. Transferir sanos cardiomiocitos que aparecen en la cámara de perfusión llena con un volumen definido de la solución de baño extracelular. 117 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM KH ₂ PO _4, 4 mM NaHCO _3, 1,7 mM de MgCl _2, 3 mM CoCl _2, HEPES 10 mM, glucosa 10 mM, y 0,02 mM de tetrodotoxina (TTX), (pH 7,4) . Utilice NaOH para ajustar el pH de valor.
3. Utilice el equipo de patch clamp (es decir IX71 microscopio invertido, un amplificador 700B MultiClamp, un sistema Digidata 1440A adquisición y PC con pClamp10.3 software (Molecular Devices)).
4. Usar pipetas de patch con resistencias de 3-5 mW cuando se llena con una solución intracelular contenía 130 mM KCl, 2 mM de MgCl _2, 11 mM HEPES, 11 mM EGTA, 5 mM Na ₂ ATP, 0,4 mM Na ₂ GTP, 5 mM Na ₂ CP y 4,9 mM CaCl ₂ (pH 7,2). Use KOH para el ajuste del valor de pH.
5. Evocar exterior K + corrientes duanillo 4,5-sec pasos de voltaje para probar potenciales entre -60 y +50 mV en incrementos de 10-mV desde un potencial de mantenimiento de -70 mV después de un 20-mseg prepulso a -40 mV.
6. Asegúrese de que las corrientes de fuga son siempre <100 pA.
7. Para la disección de K + corrientes utilizar diferentes inhibidores específicos tales como 4-aminopiridina (4-AP; ICN Biomedicals, Irvine, CA, EE.UU.), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) o tetraetilamonio (TEA, Sigma). Las soluciones madre se preparan en solución extracelular baño, y se aplica directamente a la zona más cercana posible de la célula a través de una micropunta después de "base" grabaciones. El equilibrio se debe permitir durante 2-3 min antes de "medicamentos" grabaciones.
8. Para el análisis de normalizar las amplitudes de corriente en las células individuales a tamaño celular (células enteras capacitancia de la membrana). Analizar los datos sin conexión mediante pClamp10.3 software (Molecular Devices) o software similar.

Resultados

Aislamiento de cardiomiocitos adultos murinos procedentes de ratones modificados genéticamente para estudiar la función de genes específicos de interés in vitro se ha convertido en una herramienta poderosa para entender mejor la fisiopatología cardíaca. Este método es utilizado actualmente por sólo un número pequeño pero creciente de laboratorios de ciencias básicas en todo el mundo. Sin embargo, el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares adultos murinos puede ser complicado y necesita ser hecho a fondo y r...

Discusión

Con el desarrollo creciente de cepas de ratón genéticamente modificados para el estudio de la función cardiaca y la patología cardíaca relacionada con una deleción del gen también hay un creciente interés en métodos especializados para estudiar los efectos de la deleción del gen específico in vitro. En nuestro laboratorio se estudia el papel de una familia de canales Kv subunidades accesorias sobre la repolarización cardiaca. Los genes KCNE comprenden una familia de 5 genes (KCNE1-5) que desem...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa
La tetrodotoxina	Alomone
4-aminopiridina	ICN Biomedicals
Heteropodatoxin 2	Alomone
Tetraetilamonio	Sigma Chemicals
Colagenasa de tipo 2	Worthington