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La capacidad del cerebro para cambiar en respuesta a la experiencia es esencial para la función cerebral sano, y anormalidades en este proceso de contribuir a una variedad de trastornos del cerebro 1,2. Para comprender mejor los mecanismos por los que los circuitos cerebrales reaccionan a la experiencia de un animal requiere la capacidad de monitorizar los cambios moleculares que dependen de la experiencia en un determinado conjunto de neuronas, durante un período de tiempo prolongado, en el animal vivo. Si bien la experiencia y de la actividad neural asociada se sabe para accionar los cambios de expresión génica en neuronas 1,2, la mayoría de los métodos para detectar tales cambios no permiten la observación repetida de las mismas neuronas más de varios días o no tienen suficiente resolución para observar las neuronas individuales 3 , 4. Aquí se describe un método que combina en dos fotones microscopía in vivo con un reportero codificado genéticamente fluorescente para rastrear dependientes experiencia-cambios de expresión génica en las neuronas corticales individuales sobre la curso de la experiencia día a día.
Uno de los bien establecidos que dependen de la experiencia de los genes es la actividad regulada citoesqueleto proteínas asociadas (Arc) 5,6. La transcripción de Arco es rápida y altamente inducida por la intensificación de la actividad neuronal 3, y su producto de proteína regula la endocitosis de los receptores de glutamato y largo plazo plasticidad sináptica 7. La expresión de Arco ha sido ampliamente utilizado como un marcador molecular para asignar circuitos neuronales implicados en comportamientos específicos 3. En la mayoría de estos estudios, la expresión Arc se detectó mediante hibridación in situ o inmunohistoquímica en secciones de cerebro fijos. Aunque estos métodos reveló que la expresión de Arco fue localizado en un subconjunto de neuronas excitadoras después de experiencia de comportamiento, cómo los patrones celulares de expresión Arc podría cambiar con episodios múltiples de experiencias repetidas o distintivo más días no fue investigado. ntent "> In vivo de dos fotones microscopía ofrece una poderosa manera de examinar la experiencia-dependientes cambios celulares en el cerebro de los vivos 8,9. Para habilitar el examen de expresión Arco en neuronas vivas por microscopía de dos fotones, hemos generado previamente un golpe- en línea de ratón en el que un reportero GFP se pone bajo el control del promotor endógeno del arco 10. Este protocolo describe las preparaciones quirúrgicas y procedimientos de formación de imágenes para el seguimiento dependientes experiencia-GFP Arc-patrones de expresión en conjuntos neuronales en el animal vivo. En este método , crónicas ventanas craneales se implantaron primero en ratones GFP Arc-en las regiones corticales de interés. Estos animales fueron entonces repetidamente fotografiada por dos fotones microscopía después de paradigmas de comportamiento deseadas en el transcurso de varios días. Este método puede ser aplicable en general a animales portadores otros reporteros fluorescentes de experiencia-dependientes cambios moleculares 4.