Aquí se describe un método eficaz para estudiar la dinámica de aclaramiento celular apoptótica In vivo. Este método emplea vivir Drosophila Embriones como un poderoso modelo para el monitoreo fagocitosis de las células apoptóticas mediante un etiquetado específico de las células apoptóticas y los fagocitos.
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Artículo de método
Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante
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Resumen
Resumen
La eliminación adecuada de las células no deseadas o aberrantes mediante apoptosis y la posterior fagocitosis (aclaramiento de las células apoptóticas) es crucial para el desarrollo normal en todos los organismos metazoos. Aclaramiento celular apoptótica es un proceso muy dinámico íntimamente asociada con la muerte celular, las células apoptóticas unengulfed apenas se observan in vivo en condiciones normales. Con el fin de entender los diferentes pasos de aclaramiento celular apoptótica y de comparar los fagocitos "profesionales" - macrófagos y las células dendríticas a 'no profesional' - células vecinas tejido residentes, en vivo de imágenes en vivo del proceso es extremadamente valiosa. Aquí se describe un protocolo para el estudio de aclaramiento celular por apoptosis en embriones de Drosophila vivas. Para seguir la dinámica de los diferentes pasos en la fagocitosis que utilizamos marcadores específicos de células apoptóticas y los fagocitos. Además, podemos controlar dos sistemas de fagocitos en paralelo: los macrófagos "profesionales" y "semi-profeglía ssional 'en el sistema nervioso central en desarrollo (SNC). El método descrito aquí utiliza el embrión de Drosophila como un excelente modelo para estudios en tiempo real de despacho de las células apoptóticas.
Introducción
La eliminación adecuada de las células no deseadas o aberrante a través de la apoptosis y la subsiguiente fagocitosis es crucial para el desarrollo embrionario, así como para la homeostasis del tejido en el adulto. La fagocitosis de las células apoptóticas o el aclaramiento celular por apoptosis es un proceso muy dinámico que se desarrolla en cuatro etapas: (1) la contratación de los fagocitos a la célula apoptótica ("find-me»), (2) el reconocimiento de la célula como un objetivo para la fagocitosis ( "comer-me ') y (3) inmersión, seguido de (4) la maduración del fagosoma y la degradación de la partícula apoptosis 1-5.
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Protocolo
Para seguir la dinámica de la liquidación de apoptosis de células in vivo dos poblaciones de células deberá contener: los fagocitos y las células apoptóticas.
Con motivo de las poblaciones de células fagocíticas que utilizamos una línea de Drosophila que contiene el marcador simular cytGFP, que las etiquetas de las células fagocíticas exclusivamente en el embrión: macrófagos, células gliales y ectodermo 8. Se pueden utilizar diferentes marcadores de las células fagocíticas, incluidas las líneas que contienen un controlador Gal4 hemocyte específico (CRQ-Gal4) o células gliales específicos Gal4....
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Resultados
Marcos representativos de una película en la que las células apoptóticas se etiquetan con Anexina V, y glía, ectodermo y los macrófagos se marcaron con simula-cytGFP se muestran en la Figura 2. Cada cuadro es una proyección de 3 rebanadas de 2 micras cada una.
El embrión de la etapa 15 está colocada adecuadamente mostrando el SNC de embriones en el medio con glía bien marcado (g). Los macrófagos (m), en su mayoría fuera del SNC, muestran una fuerte expresión GFP cit.......
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Discusión
Aclaramiento celular apoptótica es una última etapa crítica de la apoptosis, la cual es altamente dinámico. Por lo tanto los estudios en tiempo real del proceso son de suma importancia. Aquí se describe un protocolo que permite la supervisión del despacho de células apoptóticas en el desarrollo de embriones de Drosophila vivir. En este procedimiento, dos poblaciones de células deben marcarse mediante marcadores específicos: las células apoptóticas y los fagocitos. El reportero simular cytGFP es adecuad.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una Marie Curie Reintegración Grant (IRG249084). Damos las gracias a todos los miembros del laboratorio Kurant.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| fuerte | |||
| Anexina V | Sondas | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Sondas moleculares | L-7528 | |
| Aceite de halocarbono 700 | Sigma | H8898 | |
| < strong>Material | |||
| Tubo capilar | FHC | 30-30-0 | |
| Filtro de celdas | SPL | 93100 | |
| Pincel |
Referencias
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 78....
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Reimpresiones y permisos
