Medida de la alodinia táctil en un modelo murino de la prostatitis bacteriana

Marsha L Quick; Joseph D Done; Praveen Thumbikat

doi:10.3791/50158

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Artículo de método

Medida de la alodinia táctil en un modelo murino de la prostatitis bacteriana

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DOI:

10.3791/50158

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16 de enero de 2013

Marsha L Quick¹ , Joseph D Done¹ , Praveen Thumbikat¹

¹Department of Urology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

En este artículo

Resumen

La infección de la próstata puede ser un factor contribuyente en la mediación de dolor pélvico en la prostatitis crónica. Se describe el procedimiento para la preparación de inóculo estandarizado bacteriana, la instilación de bacterias en la uretra de ratones machos y metodología para medir la alodinia táctil en ratones con el tiempo.

Resumen

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) son patógenos que juegan un papel importante en infecciones del tracto urinario y prostatitis bacteriana ^1. Recientemente hemos demostrado que UPEC tienen un papel importante en la iniciación del dolor pélvico crónico ^2, una característica de la prostatitis crónica / síndrome de dolor pélvico crónico (CP / CPPS) ^3,4. La infección de la próstata mediante la UPEC clínicamente relevante puede iniciar y establecer el dolor crónico a través de mecanismos que pueden implicar daño en los tejidos y la iniciación de los mecanismos de autoinmunidad ^5.

Un desafío a la comprensión de la patogénesis de la UPEC en la próstata es la relativa inaccesibilidad de la glándula prostática a la manipulación. Hemos utilizado un método previamente descrito infección intrauretral ⁶ para entregar una cepa clínica de UPEC en ratones machos estableciendo así una infección ascendente de la próstata. A continuación, describimos nuestros protocolos para la normalización de la bacterial inóculo ⁷ así como el procedimiento para la cateterización anestesiados ratones machos para la instilación de bacterias.

CP / CPPS se caracteriza principalmente por la presencia de alodinia táctil ^4. Las pruebas de comportamiento se basa en el concepto de la hiperalgesia cutánea resultante de ^8-10 refiere dolor visceral. Un foco irritable en los tejidos viscerales reduce los umbrales de dolor cutáneas que permitan una respuesta exagerada a la que normalmente no dolorosos estímulos (alodinia). La aplicación de fuerza normal a la piel resultado en respuestas anormales que tienden a aumentar con la intensidad del dolor visceral subyacente. Se describe metodología en los ratones NOD / ShiLtJ que utilizan von Frey fibras para cuantificar la alodinia táctil en el tiempo en respuesta a una sola infección con bacterias UPEC.

Protocolo

1. Las bacterias Preparación para la inoculación de ratones

Lo siguiente debe ser realizado bajo condiciones asépticas.

Tome un 17 x 100 mm tubos de polipropileno con tapas y añadir 3 ml de caldo Luria (LB) medios de comunicación. Utilizando puntas de autoclave, tome un poco de caldo congelado glicerol bacterias de la cepa CP1 ² y transferir una pequeña cantidad de la cultura en el tubo que contiene el medio LB. Reemplazar la tapa del tubo para que el oxígeno es todavía capaz de entrar en el tubo - la cultura necesita para crecer en condiciones aerobias. Colocar el tubo a 37 º C en una incubadora de agitación a 220 rpm durante la noche.
El día siguiente, transferir 5 l de cultivo de una noche a un tubo nuevo con 3 ml de medio LB y crecer bajo condiciones estáticas en una incubadora durante toda la noche a 37 ° C.
El día 3 de transferencia 40 l de cultivo en tubo de 50 ml que contiene aa medio LB 40 ml cada uno. Colocar en un 37 ° C durante la noche estática incubadora.
Activar y configurar centrífuga a 4 ° C.Una vez centrífuga se ha alcanzado la temperatura final, transferir cada cultivo 40 ml en un tubo de centrífuga de 40 ml Nalgene.
Pesar los tubos de centrífuga para equilibrar - ajustar el volumen con medio LB según sea necesario. Girar los tubos a 6.000 rpm durante 20 min.
Retire con cuidado el sobrenadante y sedimento bacteriano suavemente suspender en 40 ml de PBS estéril.
Repita el paso 1.5 con PBS.
Aspirar el sobrenadante y suspensión de bacterias en 500 l de PBS estéril. Transferir la solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Tomar 10 l de suspensión y se diluye en 990 l de PBS enfriado en hielo. Utilice un espectrofotómetro para leer los OD _{420 nm} para determinar el volumen necesario para la inoculación. Para determinar el volumen adecuado de helado de PBS a suspender el pellet en: Tome el número OD _{420 nm} (en ml) y restar el volumen estimado del sedimento bacteriano [ex. OD _{420 nm} = 0,545, pellet aproximadamente 0,075 ml. 0,545 a 0,075 = 0,470].
Eliminar 10 l de suspensión bacteriana y dilaúd en 990 l de helado de PBS. Lea las _nm OD _420. El objetivo es conseguir un valor de OD _{420 nm} de la suspensión diluida de 1,000 ± 0,010. Si el número de su dilución por encima de este objetivo, añadir más volumen a la suspensión y tome otra lectura. Si el número está por debajo del .990 luego girar hacia abajo la suspensión y repetición lectura OD _{420 nm} hasta obtener la lectura deseada.

2. Animal Infección

Los ratones (5 a 7 semanas de edad, el diez por grupo) fueron adquiridos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

Los ratones son anestesiados por inhalación de isoflurano 1-4% en una cámara de plexiglás y se monitorizan hasta reclinada.
Un ratón en un momento en que se da por la instilación de bacterias por cateterismo con un polietileno (PE10) unido a un catéter modificado aguja 30 G de una jeringa de vidrio Hamilton (longitud de 1.5-2.0 cm). El catéter se inserta en el cubo de la aguja. El ratón es placed en su superficie dorsal bajo anestesia mantenida usando un cono nasal.
El pene del ratón se extruye por una presión suave y cantidades abundantes de lubricante en hisopos de algodón se utiliza para la lubricación de la entrada de la uretra del pene.
10 l de salina tamponada con fosfato que contenía 1 x 10 ⁸ bacterias se introduce en la uretra de los ratones anestesiados después de la cateterización.
Los ratones se mantienen en un estado de anestesia durante 15 min en la cámara de Plexiglas después de la introducción de bacterias para permitir la unión bacteriana y para prevenir la micción inmediata.
Los ratones se vuelven a colocar en sus jaulas y monitoreados durante las siguientes 24 horas.

3. Comportamiento de la prueba

Los ratones fueron probados antes de la infección (línea de base) y en los días 3, 7, 14, 21 y 28 después de la infección. Referido hiperalgesia y alodinia táctil se ensayó usando filamentos de von Frey aplicados al abdomen y el ^11,12 r plantaregión de la pata trasera ^13. Las pruebas se desempeñasen en un fijo de tiempo de días, la metodología estándar y pruebas experimentador único de todos los animales fueron empleados. Prueba ciega de los grupos se utilizó para combatir las limitaciones de las pruebas basadas en el comportamiento de dolor en modelos animales. Cinco individuales filamentos de von Frey con fuerzas de 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 y 4,0 g (Stoelting, EE.UU.) se aplica en el abdomen y la frecuencia de las respuestas de retirada se calculó.

Después de un período de aclimatación de 30 minutos, los ratones se colocan en cámaras individuales de plexiglás (6 x 10 x 12 cm) hechas en casa con piso de rejilla de acero inoxidable alambre.
Referido hiperalgesia y alodinia táctil se ensayaron usando los cinco filamentos de von Frey. Cada filamento se aplicó durante 1-2 segundos con un intervalo entre estímulos de 5 segundos para un total de 10 veces, y los pelos se ensayaron en orden ascendente de fuerza.
Cada filamento se aplica a la zona inferior del abdomen en la vecindad general de la próstata yse trató de estimular las diferentes áreas dentro de la región para evitar la desensibilización o "terminar" efectos. Los filamentos se aplican en orden creciente de la fuerza de 1-2 segundos, con intervalos de al menos 5 segundos entre estimulaciones para un total de 10 veces.
Hay tres tipos de comportamiento se considera una respuesta positiva a la estimulación del filamento: 1) fuerte contracción del abdomen, 2) lamer o rascar inmediata de la zona de estimulación filamento, 3) saltos.
Respuesta en frecuencia se calcula como el porcentaje de respuesta positiva (de 10, por ejemplo, 5 respuestas de 10 = 50%) y los datos se informaron como la media del porcentaje de respuesta de frecuencia ± SE
Los animales con más de 25 respuestas positivas iniciales totales se excluyeron del estudio.
La alodinia táctil se ensayó en la región plantar de la pata trasera usando los filamentos de von Frey con fuerzas de 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 y 4,0 g. La mediana del umbral del 50% por retiro (5) se evaluó mediante el arriba-abajométodo donde la prueba se inició con 0,04 g filamento aplicada perpendicularmente a la superficie plantar de la pata trasera hasta que el filamento ligeramente doblados. Los filamentos fueron probados en orden ascendente hasta una respuesta positiva se observó. Una respuesta positiva a que el filamento se definió como una retirada brusca de la pata o lamido de la pata de prueba. Cuando una respuesta positiva se registró el filamento más débil siguiente se aplicó, y si una respuesta negativa se observó, a continuación, el filamento más fuerte siguiente fue aplicada.
Los experimentos y la metodología descritos han sido revisados y aprobados por el Cuidado de Animales de la Universidad Northwestern y el empleo.