El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

Resumen

Complejos de proteínas catalizan las funciones celulares clave. Caracterización detallada funcional y estructural de muchos complejos esenciales requiere la producción recombinante. MultiBac es un sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para la expresión de proteínas eucarióticas y sus complejos. MultiBac se implementó como una plataforma de acceso libre, y los procedimientos operativos estándar desarrollados para maximizar su utilidad.

Resumen

La investigación proteómica revela la impresionante complejidad de proteomas eucariotas en un detalle sin precedentes. Ahora es un principio comúnmente aceptado que las proteínas en las células de la mayoría no existen como entidades aisladas sino que ejercen su actividad biológica en asociación con muchas otras proteínas, en los seres humanos diez o más, la formación de líneas de montaje en la célula para la mayoría si no todas las funciones vitales. ^{1 , 2} El conocimiento de la función y la arquitectura de estos conjuntos multiproteicos requiere su disposición en calidad superior y en cantidad suficiente para un análisis detallado. La escasez de muchos complejos de proteínas en las células, en particular, en los eucariotas, prohíbe su extracción a partir de fuentes nativas, y requiere la producción recombinante. El sistema vector de expresión de baculovirus (BEVS) ha demostrado ser particularmente útil para la producción de proteínas eucarióticas, la actividad de los cuales a menudo se basa en el procesamiento post-traduccional que otros sistemas de expresión comúnmente utilizados a menudo puedeno son compatibles. ³ BEVS utilizar un baculovirus recombinante en el que se insertó el gen de interés para infectar cultivos de células de insectos que a su vez producen la proteína de elección. MultiBac es un BEVS que ha sido especialmente adaptado para la producción de complejos de proteínas eucariotas que contienen muchas subunidades. ⁴ Un requisito previo importante para la producción eficiente de proteínas y sus complejos son robustos protocolos para todos los pasos implicados en un experimento de expresión que, idealmente, puede ser implementado como los procedimientos normalizados de trabajo (PNT) y seguido también por usuarios no especializados con relativa facilidad. La plataforma MultiBac en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL) utiliza procedimientos normalizados de trabajo para todos los pasos implicados en un complejo multiproteico experimento de expresión, a partir de la inserción de los genes en un genoma de baculovirus ingeniería optimizado para la producción de proteínas heterólogas propiedades para el análisis a pequeña escala de la proteína ejemplares producidos. ^5-8 La plataforma dese instala en un modo de acceso abierto en el EMBL de Grenoble y ha apoyado a muchos científicos de la academia y la industria para acelerar los proyectos de investigación complejos proteicos.

Introducción

La actividad biológica se controla por conjuntos de proteínas y otras biomoléculas que actúan en concierto para catalizar las funciones celulares. Los ejemplos notables incluyen la maquinaria que transcribe la información genética contenida en el ADN en ARN mensajero. En los seres humanos, más de 100 proteínas se unen en un proceso definido y regulado para transcribir los genes, la formación de grandes complejos multiproteicos de 10 y más subunidades incluyendo el ARN polimerasa II y los factores de transcripción generales, tales como TFIID, TFIIH y otros. ⁹ Otros ejemplos son los ribosoma, que consta de muchas proteínas y moléculas de ARN, que cataliza la....

Protocolo

1. Tandem recombinería (TR) para la creación de construcciones de expresión Multigene

1. Planificación de la estrategia de co-expresión. Enfoque de diseño para la inserción de los genes de interés en los donantes y receptores. Submódulos fisiológicas potenciales de su complejo deben agruparse en aceptores y donantes específicos. Utilice Módulo multiplicación consiste en vivienda de endonucleasa (HE) - pares BstXI de combinar módulos de expresión de los donantes individuales y los plásmidos aceptador ^7,8 Crea todas las construcciones relevantes en silico y validar la estrategia antes de continuar con el trabajo experimental....

Resultados

Fuerte co-expresión de proteínas heterólogas alcanzados por el sistema de MultiBac se muestra en la Figura 1d (sondas tomadas 48 horas después de infectar una suspensión de cultivo celular). Las bandas de proteínas sobreexpresados ​​son claramente discernibles en todo el extracto de células (SNP) y el lisado aclarado (SN). La calidad y cantidad del material de proteína producida es a menudo suficiente para permitir la determinación de la estructura de los complejos de proteínas, tales como el puesto de .......

Discusión

Vídeo instantáneas en las Figuras 2 y 3 ilustran todo el proceso de generación asistida por robot a partir de ADNc de expresión multigénica construye todo el camino a la infección de cultivos de células de insectos para la producción de proteínas. Nuevos reactivos (plásmidos y virus) y protocolos robustos se han desarrollado para permitir una tubería de depender de SOP. Toda la tubería se ha implementado como una plataforma tecnológica en el EMBL de Grenoble. La plataforma MultiBac ha s.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bluo-Gal	Invitrogen	15519-028 (1 g)
Tetraciclina	Euromedex	UT2965-B (25 g)	1.000X a 10 mg/ml
Kanamicina	Euromedex	EU0420 (25 g)	1.000X a 50 mg/ml
Gentamicina	SIGMA	G3632 (5 g)	1.000X a 10 mg/ml
IPTG	Euromedex	EU0008-B (5 g)	1.000X a 1M
Cre-recombinasa	New England BioLabs	M0298
X-Treme GENE HP reactivo de transfección	Roche	06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect	Thermo Scientific	SH 30913.02
Placa de 6 pocillos Falcon	Dominique Dutscher	353046
pipeta de 2 ml Falcon	Dominique Dutscher	357507
pipeta de 5 ml Falcon	Dominique Dutscher	357543 pipeta de
10 ml Falcon	Dominique Dutscher	357551
pipeta de 25 ml Falcon	Dominique Dutscher	357535
pipeta de 50 ml Falcon	Dominique Dutscher	357550
50 ml Falcon	Dominique Dutscher	352070
tubo de 15 ml Falcon	Dominique Dutscher
1,8 ml criotubo Nunc	Dominique Dutscher	55005
Matraces agitadores de 100 ml Pyrex	Dominique Dutscher	211917
matraces agitadores de 250 ml Pyrex	Dominique Dutscher	211918
matraces agitadores de 500 ml Pyrex	Dominique Dutscher	211919
matraces agitadores de 2 L Pyrex	Dominique Dutscher
Certomat Agitador orbital + meseta	Sartorius	4445110, 4445233
Tanque de nitrógeno líquido dewar 35 L	Fisher Scientific	M76801
Gabinete de seguridad biológica Faster	Sodipro	FASV20000606
Microscopio óptico	Zeiss	451207
Sf21 Células
de insectosHi5 Células de insectos	Invitrogen	B855-02
Tecan freedom EVO running Evoware plus	TECAN
10 μ l puntas conductoras (negro),	TECAN	10 612 516
200 μ l puntas conductoras (negro)	TECAN	10 612 510
comedero desechable para reactivos, 100 ml	TECAN	10 613 049
twin.tec placa PCR 96, con faldón	Eppendorf	0030 128.648
96 pocillo V fondo, no estéril	BD halcón	353263
96 placa de pocillo profundo color natural, PP)	Microplaca Fisher	M3752M
PS, 96 pozo de fondo plano	Greiner	655101
96 placa de pozo profundo	Thermo scientific	AB-0932
bloques de 24 pocillos RB	Qiagen	19583
DpnI enzima de restricción	NEB	R0176L	20 U/uL
NEBuffer 4 10X	NEB	B7004S
2X phusion mastermix HF	Finnzyme	ref F-531L
2X phusion mastermix GC	Finnzyme	ref F-532L
DGLB 1.5X	casero		7.5% glicerol, 0.031% azul de bromofenol, 0.031% xileno cianol FF
Escalera de masa de ADN alta para e-gel	Life Technologies	10496-016
Escalera de baja masa de ADN para e-gel	Life Technologies	10068-013
E-gel 48 1% agarosa GP	Life Technologies	G8008-01
Kit de plásmido Nucleo Spin-robot-96	Macherey Nagel	740 708.24
Kit de limpieza de PCR, Extracto de Nucleospin Robot-96	Macherey Nagel	740 707.2
Gotaq mezcla maestra verde	Promega	M7113
T4 ADN polimerasa, calificado LIC	Novagen	70099-3
DTT 100 mM	casero
Urea 2 M	EDTA casero
500 mM pH 8.0	LB casero
(Miller) 500 g	Athena ES	103

tubo de 352096211921 Caldo