El uso de quimiostatos en Microbiana Biología de Sistemas

Resumen

Tasa de crecimiento celular es un proceso regulado y un determinante principal de la fisiología celular. Cultivo continuo usando quimiostatos permite el control extrínseca de la tasa de crecimiento de las células por la limitación de nutrientes facilitar el estudio de las redes moleculares que controlan el crecimiento celular y cómo estas redes evolucionan para optimizar el crecimiento celular.

Resumen

Las células regulan su tasa de crecimiento en respuesta a señales desde el mundo exterior. A medida que la célula crece, diversos procesos celulares deben estar coordinados incluyendo la síntesis macromolecular, metabolismo y en última instancia, el compromiso con el ciclo de división celular. El quimiostato, un método de controlar experimentalmente tasa de crecimiento celular, proporciona un medio poderoso para estudiar sistemáticamente cómo afecta la tasa de crecimiento de los procesos celulares - incluyendo la expresión génica y el metabolismo - y las redes reguladoras que controlan la tasa de crecimiento de las células. Cuando mantenido por cientos de generaciones quimiostatos se puede utilizar para estudiar la evolución de adaptación de microbios en las condiciones ambientales que limitan el crecimiento celular. Se describe el principio de las culturas chemostat, demostrar su funcionamiento y ofrecer ejemplos de sus diversas aplicaciones. Tras un período de inactividad después de su introducción en el medio del siglo XX, la convergencia de las metodologías a escala del genoma con un renovado enterés en la regulación del crecimiento celular y la base molecular de la evolución adaptativa es estimular un renacimiento en el uso de quimiostatos en la investigación biológica.

Introducción

El crecimiento de las células está regulada por complejas redes de interacción de factores genéticos y ambientales ^1,2. La regulación multifactorial del crecimiento celular requiere un enfoque a nivel de sistema para su estudio. Sin embargo, el estudio riguroso de crecimiento celular regulada se ve desafiada por la dificultad de controlar experimentalmente la velocidad a la que crecen las células. Por otra parte, incluso en los experimentos simples condiciones extracelulares son con frecuencia dinámico y complejo como células alteran continuamente su entorno ya que proliferan. Una solución a estos problemas es proporcionada por el quimiostato: un método de....

Protocolo

El principio de cultivo continuo utilizando un quimiostato se puede realizar en una variedad de implementaciones. En todos quimiostatos que es esencial contar con 1) los métodos para mantener la esterilidad de todos los componentes, 2) una cultura bien mezclado, 3) la aireación adecuada del recipiente de cultivo y 4) un medio fiable de adición de los medios y la cultura de eliminación. Aquí, se describe el uso de un biorreactor Sixfors (Infors Inc) como un quimiostato usando métodos que se pueden adaptar fácilmente a configuraciones alternativas.

1. Montaje de los buques Chemostat

1. Encienda los Sixfors utilizando el interruptor ....

Resultados

Una ventaja importante de quimiostatos es la capacidad de controlar la tasa de crecimiento de las células experimentalmente mediante la variación de la tasa de dilución. En la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae, la morfología de una célula es informativo de su fase en el ciclo de división celular. Las poblaciones con tasas de crecimiento más altas contienen una mayor proporción de división activa las células según se determina mediante la medición de la fracción de células unbudded (Figura 5A).

Discusión

Quimiostatos permiten el cultivo de microbios en condiciones de estado estacionario de crecimiento controlado. Las células crecen continuamente a una velocidad constante que resulta en un ambiente externo invariante. Esto es en contraste con los métodos de cultivo por lotes en el que el entorno externo está cambiando continuamente y la tasa de crecimiento de las células se determina por la interacción compleja de medio ambiente y genotipo. Por lo tanto, una ventaja importante de cultivo de microbios en quimiostatos más .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Infors-HT Sixfors Chemostat	Recursos Técnicos Apropiados, Inc.
Botella de vidrio 9.5 L	Fisher Scientific	02-887-1	para recipiente de medios y manguera
Pinchcock	Fisher Scientific	05-867	para recipiente de medios y
tapón de manguera, tamaño 12, neopreno verde	Cole-Palmer	EW-62991-42	para recipiente de medios y manguera
recto	Cole-Palmer	EW-30703-02	para recipiente de medios y manguera
general Propósito Lazos 4 en	Fisher Scientific	NC9557052	Para recipiente de medios y tubos de manguera
, piezas pequeñas de caucho de silicona			B000FMWTDE para recipientes de medios y tubos de manguera
silicona, 3/8 pulgadas de diámetro	exterior Fisher Scientific	02-587-1Q	para recipientes de medios y
mangueras Tubería, silicona, 7/32 pulgadas de diámetro exterior	Fisher Scientific	02-587-1E	para recipientes de medios y mangueras
Tubería, acero inoxidable, 3/16 pulgadas de diámetro exterior	McMaster-Carr	6100K164	para recipiente de medios y manguera
Tubos, acero inoxidable, 3/8 pulgadas de diámetro exterior	McMaster-Carr	6100K161	para recipiente de medios y
conectores de gancho de	Fisher Scientific	14-66-18Q	para recipiente de medios y
manguera abrazadera de trinquete	Cole-Palmer	EW-06403-11	para recipiente de medios y manguera
Luer,	Cole-Palmer	EW-45512-34	para recipiente de medios y luer de manguera
, Cole-Palmer macho		EW-45513-04	para recipiente de medios y manguera
Millipore Aervent MTGR05010 filtro de 62 mm, 0.2 μ m	Fisher Scientific	MTGR05010	para recipientes de medios y mangueras
de PTFE Acrodisc CR 13 mm filtros, 0,2 μ m	Fisher Scientific	NC9131037	para recipiente de medios y manguera
Tubo de flujo de lectura directa para aire	Cole-Palmer	EW-32047-77	para configuración de gas nitrógeno
Tubo de flujo de lectura directa para nitrógeno	Cole-Palmer	EW-32048-63	para configuración de gas
nitrógeno Dosificador de gas Marcos multitubo	Cole-Palmer	EW-03218-50	para configuración
de gas nitrógenoregulador, analítica de dos etapas Airgas		Y12-N145D580	para configuración de gas nitrógeno
Adaptador de manguera, acero inoxidable Airgas		Y99-26450	para gas
Adaptador macho de manguera	Airgas	WES544	para configuración de gas nitrógeno
Tubería Norprene	US Plastics	57280	para configuración de gas nitrógeno
Base de trípode	Cole-Palmer	EW-03218-58	Para Gas Nitrógeno
Montaje Cartuchos de Válvula	Cole-Palmer	EW-03217-92	Para Montaje de Gas Nitrógeno Garra
10 L	Fisher Scientific	02-963-2A	Para Preparación
Medios Steritop Filtros estériles de tapa de botella de vacío, 1.000 ml, membrana de PES; para tamaño de cuello de 45 mm	Fisher Scientific	SCGP-T10-RE	Para
Preparación de Medios Botella de Medios 100 ml, tamaño	de cuello de 45 mmFisher Scientific	FB-800-100	para la preparación de medios
cloruro de calcio y middot; 2H2O	Fisher Scientific	C79-500	Media Reactivos
cloruro de sodio	Fisher Scientific	BP358-1	Media Reactivos
sulfato de magnesio· 7H2O	Sigma Aldrich		230391 Reactivos
de medios fosfato de potasio monobásico	Fisher Scientific	AC424205000	Media Reactivos
sulfato de amonio	Fisher Scientific	AC423400010	Media Reactivos
de	Sigma Aldrich	P9541	Reactivos de medios
bórico	Sigma Aldrich	B6768	Reactivos de medios
sulfato de cobre y middot; 5H2O	Sigma Aldrich	209198	Reactivos
de medios yoduro de potasio	Sigma Aldrich	60400	Reactivos
de medios cloruro férrico· 6H2O	Reactivos de medios	Fisher Scientific	I88-100
sulfato de manganeso· H2O	Sigma Aldrich	230391	reactivos de
medios molibdato de sodio· 2H2O	Sigma Aldrich	M7634	Reactivos
de medios sulfato de zinc· 7H2O	Reactivos	medios	Fisher Scientific Z68-500
biotina	Reactivos	Fisher Scientific BP232-1	Reactivos
de medios pantotenato de calcio	Fisher Scientific	AC24330-1000	Reactivos de medios
fólico	Sigma Aldrich	F7876	Reactivos de medios
inositol (también conocido como mioinositol)	Fisher Scientific	AC12226-1000	Reactivos de medios
niacina (también conocido como ácido nicotínico)	Sigma Aldrich	N4126	Reactivos de medios
p-aminobenzoico	Fisher Scientific	AC14621-2500	Reactivos de medios
piridoxina HCl	Sigma Aldrich	P9755	Reactivos de medios
riboflavina	Sigma Aldrich	R4500-25G	Reactivos de medios
tiamina HCl	Fisher Scientific	BP892-100	Reactivos de medios
Leucina	Sigma Aldrich	L8000-100G	Reactivos de medios
Uracil	Sigma Aldrich	U0750	Reactivos de medios
Dextrosa	Fisher Scientific	DF0155-08-5	Reactivos de medios

conector , manguera hembra nitrógeno de potasio ácido de de medios ácido ácido