Los microARNs tienen funciones importantes en la estructura y función del cerebro. Aquí se describe un método para hacer cumplir miRNA hipocampo sobreexpresión mediante inyección estereotáxica de un lentivirus que expresan los genes miARN ingeniería. Este enfoque puede servir como una manera relativamente rápida para evaluar la In vivo Efectos de miRNAs sobreexpresados en regiones específicas del cerebro.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Inyección estereotáctica de microARN que expresan lentivirus al ratón hipocampo CA1 Región y evaluación de los resultados del comportamiento
En este artículo
Resumen
Resumen
Los microARN (miRNA) son pequeñas moléculas de ARN de cadena simple reguladoras unos 22 nucleótidos de longitud que pueden cada destino numerosas transcripciones de ARNm y dim toda una expresión de los genes de la vía de la destrucción de inducir y / o inhibición de la traducción de estos objetivos. Varios miRNAs juegan un papel clave en el mantenimiento de la estructura y la función neuronal y en las funciones cerebrales de alto nivel, y se buscan métodos para manipular los niveles para explorar estas funciones. A continuación, presentamos un método directo en vivo para el examen de las consecuencias cognitivas de miRNAs forzadas exceso en ratones mediante la inyección estereotáxica de partículas virales miRNA-codificación. Específicamente, el protocolo actual consiste en la inyección en la región CA1 del hipocampo, lo que contribuye a la consolidación de mamífero memoria, el aprendizaje, y las respuestas al estrés, y ofrece un lugar de la inyección conveniente. Las coordenadas se miden de acuerdo con el bregma ratón y virus de la perfusión se controla y se mantiene muy lento digitalmente.Después de la inyección, la herida de la cirugía se cierra herméticamente y los animales recuperarse. Los lentivirus que codifican silenciadores de los objetivos de mRNA correspondientes sirven para implicar a la interacción específica de los genes miARN / target responsable del efecto observado, con los ratones no tratados, los ratones inyectados con solución salina y ratones inyectados con vectores lentivirus "vacías" como controles. Un mes después de la inyección, los animales se examinan en el laberinto de agua de Morris (MWM) para la evaluación de su aprendizaje navegación y capacidades de la memoria. El MWM es un tanque redondo lleno de agua coloreada con una pequeña plataforma sumergida 1 cm por debajo de la superficie del agua. Señales visuales estable alrededor del tanque para permitir la navegación espacial (sonido y el campo magnético de la tierra también puede ayudar a los animales en la navegación). Vigilancia de la cámara de vídeo permite la medición de la ruta de la natación y el tiempo para encontrar y constituir la plataforma. El ratón se enseña por primera vez que el montaje de la plataforma escondida ofrece un escape de la natación forzada, sino que se prueba para el uso de este escape y finalmente, la plataforma se retira y las pruebas de la sonda examinar si el ratón recuerda su ubicación anterior. Pruebas repetidas durante varios días consecutivos destacan un mejor rendimiento de los ratones examinados en latencias más cortas para encontrar y montar la plataforma, y las rutas que más directas para llegar a la plataforma o la ubicación. Si no se presenta dicha mejora representa problemas de aprendizaje y de la memoria y / o ansiedad, que puede entonces ser probado específicamente (por ejemplo, en el laberinto elevado en cruz). Este enfoque permite la validación de miRNAs específicos y las transcripciones de destino en lo cognitivo estudiado y / o procesos relacionados con el estrés.
Introducción
El papel de los miRNAs específicos en el funcionamiento del sistema nervioso ha sido recientemente cuestionado por inyección lentiviral en varios estudios. MiRNAs se han encontrado para ser crucial para el mantenimiento y la re-formación de la estructura sinapsis 1, 2 sinaptogénesis y la remodelación de sinapsis y mantenimiento 3. Estos estudios sugieren fuertemente que los miRNAs están comprometidos, a través de efectos reguladores múltiples niveles, tanto en la conformación y en el mantenimiento de la salida principal del sistema nervioso, la función cognitiva. Inyección estereotáctica de las partículas de lentivirus en regiones específicas en....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación Lentivirus
- Se cultivan las células HEK-293FT a 90% de confluencia.
- En el día de la transfección medio celular cambio de DMEM libre de suero suplementado con 1 mM de glutamina y 50 mg / ml de penicilina-estreptomicina.
- Co-transfectar las células con un vector pLKO.1-Puro y con plásmidos que codifican para la delta R8.2 y VSV-G restos y los genes miARN de interés, utilizando 10 l de 1 mg / ml de polietilenimina como un portador 9.
- Recoger lentivirus envasados a las 24 horas y 48 horas después de la transfección, filtrar con filtro de 0,45 micras.
- Concentrar los lentivirus utilizando ultracen....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La inyección de 0,5 l lentivirus en la región CA1 en el hipocampo del ratón, con la velocidad de flujo se indica en la sección de protocolo produce una esfera infectada de alrededor de 1 mm en el eje rostral caudal, y alrededor de 0,5 mm en la dirección medial-lateral y la parte anterior -posterior ejes (Figura 3).
Figura 1. Punto de bregma y aparato de inyec.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Inyección estereotáctica de un lentivirus es relativamente un método rápido para la evaluación in vivo, tanto para la altura o baja regulación de genes diferentes y miRNAs. La principal alternativa es un ratón genéticamente modificado que es una técnica consume mucho más laborioso y a continuación, inyección directa lentivirus. Además, la regulación hacia arriba, en la inyección de lentivirus, se produce en un momento específico en el ratón adulto y no incluye la posibilidad de permeabilidad durante el.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este estudio ha sido financiado por el Centro de Edmond Safra y Lily para las Ciencias del Cerebro (SB comunión), The Heritage Biomédica Programa de Asociación de Ciencia legado de la Israel Science Foundation (Grant N º 378/11, a HS) y la Fundación Alemana para la Ciencia de Israel Investigación y Desarrollo (GIF) (Grant No. 1093-32.2/2010, a HS).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Escala de pesaje para roedores | Burtons (UK) | 115-455 | |
| almohadilla térmica | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| Stoelting | 51465 | ||
| estereotact | Stoelting | 51730 | |
| Bisturí y cuchillas | Kent scientific | ||
| Jeringa Harland Hamilton | 7632-01 | ||
| perforadora | Stoelting | 51449 | |
| bomba digital | Harvard aparato | 704507 | |
| Tanque de agua y plataforma | Stoelting | 60135 | |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | ||
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer salud animal | 24751 | |
| ungüento humectante - Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| solución salina | Sigma Aldrich | D8662 |
Referencias
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
