Técnicas optogenético han hecho posible el estudio de la contribución de las neuronas específicas de comportamiento. Se describe un método en larvas de pez cebra para la activación de las neuronas somatosensoriales individuales que expresan una variante canalrodopsina (Chef) con un bombeado por diodos de estado sólido (DPSS) láser y el registro de los comportamientos provocados con una cámara de vídeo de alta velocidad.
Artículo de método
Optogenético La activación de las neuronas somatosensoriales pez cebra utilizando Chef-tdTomato
En este artículo
Resumen
Resumen
Larvas de pez cebra se están convirtiendo en un modelo para describir el desarrollo y la función de simples circuitos neuronales. Debido a su fertilización externa, el rápido desarrollo, y la translucidez, en particular el pez cebra se presta a los enfoques optogenético para investigar la función de circuitos neuronales. En este enfoque, sensibles a la luz los canales de iones se expresan en neuronas específicas, permitiendo que el experimentador para activar o inhibir a voluntad y por lo tanto evaluar su contribución a comportamientos específicos. La aplicación de estos métodos en larvas de pez cebra es conceptualmente simple, pero requiere la optimización de los detalles técnicos. Aquí se demuestra un procedimiento para la expresión de una variante en larvas de pez cebra canalrodopsina neuronas somatosensoriales, foto-activación de las células individuales, y el registro de los comportamientos resultantes. Mediante la introducción de algunas modificaciones a los métodos previamente establecidos, este enfoque podría ser utilizado para provocar respuestas de comportamiento de neuronas individuales activados hastaa por lo menos 4 días después de la fertilización-(DPF). En concreto, hemos creado un transgén utilizando una neurona somatosensorial potenciador, CREST3, para conducir la expresión de la variante etiquetados canalrodopsina, Chef-tdTomato. Inyectando este transgén en los embriones de 1-etapa de células resulta en una expresión mosaico en las neuronas somatosensoriales, que se pueden obtener imágenes de microscopía confocal. Illuminating identificado células en estos animales con la luz de un láser DPSS 473 nm, guiado a través de un cable de fibra óptica, provoca comportamientos que se pueden grabar con una cámara de vídeo de alta velocidad y analizados cuantitativamente. Esta técnica podría adaptarse a las conductas de estudio provocados por la activación de cualquier neurona pez cebra. La combinación de este método con perturbaciones genéticas o farmacológico será una manera poderosa para investigar la formación del circuito y la función.
Introducción
El desarrollo de métodos optogenética para promover o inhibir la excitabilidad neuronal con longitudes de onda definidas de luz ha permitido estudiar la función de las distintas poblaciones de neuronas en los circuitos neurales que controlan el comportamiento de 1, 19, 21. Esta técnica se utiliza a menudo para activar grupos de neuronas, pero también puede ser usado para activar las neuronas individuales. Larvas de pez cebra son particularmente susceptibles a estos métodos ya que son translúcidas, su sistema nervioso se desarrolla rápidamente, y la creación de animales transgénicos es rápido y de rutina. Sin embargo, importantes obstáculos técnicos se debe....
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Protocolo
Preparar el siguiente antes de tiempo.
1. Prepare el cable óptico
- Crear una unidad de almacenamiento para el cable de fibra óptica por fusión del cuello cónico de una pipeta Pasteur de vidrio sobre un mechero de Bunsen para crear un ángulo de ~ 150 °.
- Usando un cortador de alambre o una hoja de afeitar, corte con cuidado el cable de fibra óptica en dos partes. Cada pieza debe tener un extremo con una FC / adaptador de PC y un extremo expuesto. La tienda de una sola pieza como un cable de reserva.
- Pelar el cable de fibra óptica hasta el revestimiento mediante la eliminación de la cubierta de la fibra y fibras....
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Resultados
Figura 1. Cable óptico configurado. (A) Capas de un cable de fibra óptica. (B) de fibra óptica por cable pelado en una pipeta Pasteur. (C) El cable de fibra óptica en pipeta Pasteur coloca utilizando un micromanipulador.
Figura 2. Inyección plantilla mo.......
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Discusión
Hemos descrito un enfoque para la activación de las neuronas optogenético RB individuales en el pez cebra en vivo. Nuestro método emplea transgénesis transitorio para expresar una variante fluorescente etiquetados canalrodopsina, Chef-tdTomato 13, en determinadas neuronas somatosensoriales. Este enfoque puede ser fácilmente adaptado para el uso en otras poblaciones de larvas de pez cebra celulares.
Usando este enfoque consistente suscitó respuestas conductuales 34 a 48 larvas hpf .......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen ningún interés en competencia financiera.
Agradecimientos
Damos las gracias a Fumi Kubo, Thiele y Tod HerwigBaier (UCSF / Max Planck Institute) para el asesoramiento sobre los experimentos de comportamiento y DPSS láser establecidos; Heesoo Kim y Chiara Cerri de la MBL Curso de Neurobiología de ayudar en Chef-tdTomato experimentos; PetronellaKettunen (Universidad de Gotemburgo ) para la colaboración inicial de los experimentos optogenético; BaljitKhakh, Eric Hudson, Baca Mike y John Milligan (UCLA) para el asesoramiento técnico, y Roger Tsien (UCSD) para el chef-tdTomato construir. Este trabajo fue apoyado por un NRSA (5F31NS064817) Premio a AMSP y una subvención de la NSF (RIG: 0819010) a AS.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo / material | Empresa | Número de Catálogo | Comentarios |
| Materiales | |||
| Pipeta Pasteur de vidrio | Pescador | 1367820B | o equivalente (10-15 mm de diámetro) |
| 200 m de fibra óptica | Thorlabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, longitud: 3 m, Final A: FC / PC, Final B: FC / PC, Chaqueta: FT030 |
| 50 de fibra óptica micras | Thorlabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, longitud: 3 m, Final A: FC / PC, Final B: FC / PC, Chaqueta: FT030 |
| Pelacables ajustable | Thorlabs | AFS900 | o de tres agujeros Stripping Tool (FTS4) |
| Diamond escriba Wedge | Thorlabs | S90W | |
| Flaming / Brown Micropipeta Puller | Sutter Instruments | P-97 | o equivalente |
| Tubos de vidrio borosilicato con filamento | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| Molde de inyección | n / a | n / a | Figura 5 |
| 1,5 ml tubos de centrífuga | Cualquier | Cualquier | |
| Placa de Petri (100x15 mm) | Cualquier | Cualquier | |
| Placa de Petri (60x15 mm) | Cualquier | Cualquier | |
| Presión del inyector | ASI | MPPI-3 | o equivalente |
| Micromanipulador y stand de metal | Narashige | M152 | o equivalente |
| Pipetas de plástico desechables | Fisherbrand | 13-711-7 | o equivalente |
| Poker (titular Pin pin Insecto) | Fine Ciencia Tools, Inc. | 26018-17 y 26000-70 | o equivalente |
| Fórceps | Fine Ciencia Tools, Inc. | 11255-20 | o equivalente |
| Microloader puntas de pipeta | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28,5 ° C incubadora | cualquier | cualquier | |
| 42 ° C bloque de calor | Cualquier | Cualquier | |
| No estériles hojas de bisturí # 11 | Bellas Herramientas Científicas, Inc. | 10011-00 | o equivalente |
| Disección shacer frente a | Zeiss | Stemi | o equivalente |
| Fluorescente microscopio de disección con filtro estándar | Cualquier | cualquier | o equivalente |
| Microscopio confocal | Zeiss | LSM 510 o 710 | u objetivos equivalentes con láser para las buenas prácticas agrarias y RFP, y 10x, 20x y 40x |
| Cámara de alta velocidad | Tecnologías de la AOS, Inc. | X-PRI (130.025-10) | o equivalente |
| 473 nm láser portátil | Láseres de cristal | CL-473-050 | o poder superior, con la opción TTL |
| S48 estimulador | Astro-Med, Inc. Grass Instrument división | S48K | o equivalente |
| FC / PC con el manguito de acoplamiento FC / PC | Thorlabs | ADAFC1 | May need para la conexión de cable óptico |
| Seguridad de láser Gafas | Thorlabs | LG10 | o equivalente |
| 24 placas de cultivo | Genesee | 25-102 | o equivalente |
| Diapositivas individuales depresión | Pescador | S175201 | O el equivalente |
| Reactivo | |||
| Instantánea océano | Ecosistemas Acuáticos | IS50 | |
| Azul de metileno | Pescador | S71325 | |
| Rojo fenol | Sigma | P4758 | |
| Agarosa | EMD | 2125 | o equivalente |
| Agarosa de bajo Melt | Sigma | A9045 | o equivalente |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Tricaína | Sigma | A5040 | |
| agua azul / embrión | 10 L ddH 2 O 0,6 g Instant Ocean 6 gotas de azul de metileno | ||
| rojo fenol | (5 mg / ml en 0,2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0,150 g PTU 50 ml ddH 2 O disolver a 70 ° C y agitar con frecuencia alicuotar y almacenar a -20 ° C | ||
| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml azul / peces de agua | ||
| Tricaína solución madre | 400 mg tricaína 97,9 ddH 2 O | ||
| ~ 2,1 ml de Tris 1 M, pH 9,0 | ajustar el pH a 7,0 ~ tienda en 4 ° C o -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo |
Referencias
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional start....
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