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Artículo de método

Extracelularmente Identificar las neuronas motoras de un músculo en la piscina Motor

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DOI:

10.3791/50189

⸱

25 de marzo de 2013

 ,  , 
1Department of Biology, Case Western Reserve University , 2Department of Neurosciences, Case Western Reserve University , 3Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

En este artículo

Resumen

En los animales con grandes neuronas identificadas ( Por ejemplo, Moluscos), el análisis de los conjuntos motores se realiza utilizando técnicas intracelulares 1,2,3,4. Recientemente, hemos desarrollado una técnica para estimular extracelularmente y registrar las neuronas individuales en Aplysia californica 5. Describimos ahora un protocolo para el uso de esta técnica para identificar de forma única y caracterizar las neuronas motoras dentro de un grupo motor.

Resumen

En los animales con grandes neuronas identificadas (por ejemplo, moluscos), el análisis de los conjuntos motores se realiza utilizando técnicas intracelulares 1,2,3,4. Recientemente, hemos desarrollado una técnica para estimular extracelularmente y registrar las neuronas individuales en Aplysia californica 5. Describimos ahora un protocolo para el uso de esta técnica para identificar de forma única y caracterizar las neuronas motoras dentro de un grupo motor.

Esta técnica tiene ventajas extracelular. Primeros electrodos extracelulares, puede estimular y registrar las neuronas a través de la vaina 5, por lo que no necesitan ser removidos. Así, las neuronas serán más saludables en los experimentos extracelulares que en los intracelulares. En segundo lugar, si los ganglios son girados por adecuada fijación de la vaina, electrodos extracelulares pueden acceder a las neuronas en ambos lados del ganglio, que hace que sea más fácil y eficiente para identificar múltiples neuronas en la misma preparación. En tercer lugar, extracelulareslar electrodos no necesitan penetrar en las células, y por lo tanto puede ser fácilmente movido hacia atrás y adelante entre las neuronas, se produce menos daño a ellos. Esto es especialmente útil cuando se intenta grabar múltiples neuronas durante repitiendo los patrones motores que sólo pueden persistir por minuto. Cuarto, los electrodos extracelulares son más flexibles que los intracelulares durante los movimientos musculares. Electrodos intracelulares pueden sacar y dañar las neuronas durante las contracciones musculares. En contraste, desde electrodos extracelulares se presiona suavemente sobre la vaina anterior neuronas, por lo general permanecer por encima de la misma neurona durante las contracciones musculares, y por lo tanto se pueden utilizar en preparaciones más intactas.

Para identificar las neuronas motoras para una piscina motor (en particular, el músculo I1/I3 en Aplysia) utilizando electrodos extracelulares, se pueden utilizar las funciones que no requieren mediciones intracelulares como criterios: tamaño soma y ubicación, proyección axonal, y la inervación del músculo 4, 6,7. Para el grupo de motor particular utilizado para ilustrar la técnica, se registraron a partir de nervios bucales 2 y 3 para medir las proyecciones axonales, y se midieron las fuerzas de contracción del músculo I1/I3 para determinar el patrón de inervación del músculo para las neuronas motoras individuales.

Se demuestra el proceso completo de la primera neuronas motoras que identifican utilizando la inervación del músculo, a continuación, la caracterización de su tiempo durante los patrones motores, la creación de un método simplificado de diagnóstico para la identificación rápida. El método de diagnóstico simplificada y más rápida es superior para las preparaciones más intactas, por ejemplo, en la preparación de la masa suspendida bucal 8 o 9 in vivo. Este proceso también se puede aplicar en otros conjuntos motores 10,11,12 en Aplysia o en otros sistemas de animales 2,3,13,14.

Protocolo

1. Preparación del plato de grabación

  1. Durante los experimentos de fuerza del transductor, los ganglios bucal, ganglio cerebral, y la masa bucal se colocan en un plato redondo Pyrex que está especializada para los estudios de fuerza.
  2. Para inducir ingestivo similares a los patrones de los experimentos, se necesita aplicar el carbacol no hidrolizable agonista colinérgico al ganglio cerebral 15. Para evitar el contacto directo de carbacol en los ganglios de la bucal y la masa bucal, cámaras separadas se requiere para aislar el ganglio cerebral de los ganglios de la bucal y la masa bucal (Figura 1).
  3. Puesto que la masa bucal es mucho más gruesa que los ganglios bucal, que no se colocará en el mismo nivel. Por lo tanto, este plato debe tener una cámara posterior para el ganglio cerebral (área A en la Figura 1), una plataforma para el medio ganglios bucal (zona C en la Figura 1), y una cámara mucho más profunda delante de la masa bucal (zona D en Figura 1).
  4. Para crear este plato, comenzar con una ronda plato 100x15 Pyrex (15 mm de altura, 100 mm de diámetro). Construcción del plato se requieren varios vierte de Sylgard. Siga las instrucciones proporcionadas con el producto Sylgard. Sylgard se debe permitir establecer entre vierte diferente.
  5. El primer vertido es crear el mayor nivel de Sylgard en el plato (área B en la Figura 1), que es la pared entre la plataforma intermedia y la cámara posterior.
  6. Utilice dos soportes de arcilla de modelar para aislar el área de Sylgard pared (área B en la Figura 1). Cubra los soportes de modelado de arcilla con una envoltura de plástico donde se pondrá en contacto con el Sylgard para facilitar su retiro. Asegúrese de cierres herméticos en los bordes, donde plastilina pondrá en contacto con el plato, para reducir al mínimo las fugas.
  7. Verter Sylgard en la parte situada entre los dos soportes de arcilla de modelar casi hasta la parte superior del plato. Que el Sylgard plenamente establecido durante la noche. Mantener el recipiente en un lugar cálido inducirárápido ajuste. Retire los soportes de arcilla de modelado y limpiar cualquier residuo de arcilla en el Sylgard.
  8. A continuación, la cámara posterior (área A en la Figura 1) y la plataforma media (zona C en la Figura 1) debe ser vertido.
  9. Colocar un soporte de arcilla de modelar sobre 5 mm de distancia de la superficie frontal de la Sylgard para la sección de la plataforma media (zona C).
  10. Verter Sylgard en las secciones de la cámara posterior (zona A) y la plataforma intermedia (zona C) hasta una altura de aproximadamente 3-5 mm por debajo del nivel superior de la primera pared Sylgard (zona B). La superficie Sylgard de la cámara de retorno debe ser un poco menor que la de la plataforma del medio para evitar las fugas desde la cámara posterior que contiene carbacol a la plataforma intermedia. Una vez más, vamos a la Sylgard plenamente establecido durante la noche y luego retire el respaldo plastilina.
  11. El paso final consiste en cortar una muesca en el centro de la pared Sylgard para proporcionar un canal para los conectivos cerebral-vestibulares (CBC) para irpor entre la plataforma intermedia y la cámara trasera. El ancho de esta muesca debe ser de aproximadamente 3-4 mm, que es lo suficientemente amplia como para los CBC. La parte inferior de la muesca no debe ser inferior a la superficie de la plataforma Sylgard medio para evitar fugas. Una cuchilla de bisturí puede ser usado para cortar la muesca.

2. Preparación del electrodo

  1. Tire de electrodos extracelulares de vidrio de un solo cañón capilar de vidrio con un llameante-Brown micropipeta extractor como se describe por McManus et al. 8 en la sección 3.1. Con el filamento FT345B en el extractor, nuestros ajustes de programa típicos son de calor 480, Pull 50, velocidad 13, y la hora 20, pero cuenta que la configuración será diferente para los diferentes filamentos. Este programa crea los electrodos en un solo tirón con ninguna de las etapas de pulido de fuego. El tamaño de la punta del electrodo debe ser más pequeño que el tamaño de los cuerpos celulares. Para las neuronas motoras que van desde 50 micras a 400 micras en diámetro soma, el interior diameters de los electrodos de vidrio extracelulares debe ser de aproximadamente 40 micras y sus resistencias debe ser de aproximadamente 0,1 mW cuando se llenan con solución salina Aplysia.
  2. Tire de electrodos de succión de la tubería de polietileno con un mechero Bunsen. Corte un pedazo de tubo de polietileno de unos 10 cm de largo. Mantenga el tubo en ambos extremos y colocarla muy cerca de la llama generada por el quemador Bunsen mientras gira el tubo hasta que se ablande con el calor. Estirar el tubo con cuidado a lo largo de su longitud mientras se mueve lejos de la llama. La parte media del tubo se alargadas y estrechas que el tubo se estira.
  3. Cortar el tubo en un medio para formar dos electrodos de succión. Electrodos de succión se aplica generalmente a los extremos cortados de los nervios o los músculos, aunque a veces se puede aplicar al paso.
  4. Crear electrodos de gancho para las grabaciones nerviosas siguiendo el protocolo descrito por McManus et al 8 en las secciones 3.2-3.13. Estos electrodos son especialiado útil cuando un nervio o músculo no se corta.

3. Gancho de fijación del electrodo

  1. Diseccionar el animal y eliminar la masa bucal siguiendo el protocolo descrito en McManus et al. 8 sección 4.
  2. Para la grabación y la estimulación, los electrodos de gancho se puede unir a un número de diferentes nervios.
  3. Para caracterizar los patrones como se ha hecho in vivo por Cullins y Chiel 9, las grabaciones se debe obtener de la I2 nervio y músculo que indica la fase de prolongación de alimentación 16, el nervio radular (RN) que indica el cierre de la pinza de agarre de alimentos 17, bucal nervio 2 (BN2) y bucal del nervio 3 (BN3) que indican la fase de retracción 17,18. La unión de los electrodos de gancho sigue un procedimiento similar al descrito por McManus et al 8, sección 5.
  4. Las localizaciones de estos nervios se refieren a este esquema de un aparato de alimentación de Aplysia se muestra en laFigura 2 de McManus et al 8. Tenga en cuenta que los BN2 trifurcates en ramas a, b, c y antes de ir por debajo del músculo I1 en la ranura lateral. Una rama de una primera rama es la de separar del tronco principal, y es adyacente a la BN3.
  5. La nomenclatura de las ramas a, b, y c se utilizó por Warman y Chiel 18. Ramas a, b, y c se corresponden con ramas 3, 2, y 1, respectivamente, en la nomenclatura utilizada por Nargeot et al. 19. Además, la RN, BN1 el, BN2, y BN3 la corresponden a los nervios 1, 6, 5, y 4, respectivamente, en la nomenclatura utilizada por Kandel 20 y Scott et al. 21
  6. Para estudiar la inervación muscular del músculo I1/I3, todos los nervios, excepto nervios bucales 2 será separada de la masa bucal durante los experimentos. Por lo tanto, se utilizó un electrodo de gancho para grabar desde la BN2.
  7. Puesto que el nervio I2 y la RN no se adjunta a la masa bucal, y son muy difíciles de acceder con electrodos de gancho, es preferible aplicar electrodos de succión para grabar en lugar de ellos. Vamos a describir la aplicación de electrodos de aspiración en la sección 7.
  8. Utilizar un electrodo de gancho o un electrodo de succión para grabar desde la BN3, debido a que es de fácil acceso mediante uno u otro tipo de electrodo. Hemos elegido utilizar un electrodo de gancho para los BN3 grabaciones para minimizar el número de manipuladores para la celebración de los electrodos de succión, y para ahorrar espacio para manipuladores de otros productos o equipos.
  9. Conecte un electrodo de gancho a la rama de un BN2 (BN2-a) para iniciar rechazo-como los patrones durante los experimentos. Es útil para conectar un electrodo de gancho adicional a la BN2-una en el otro lado, debido a que algunas neuronas responden de manera diferente a la ipsilateral vs contralateral BN2-una estimulación.
  10. Para ayudar a distinguir las neuronas con proyecciones unilaterales vs bilateral,también es útil para unir electrodos de gancho para BN2 y BN3 la del otro lado de los ganglios bucal.

4. Ganglios y preparación muscular

  1. Los ganglios bucal, ganglio cerebral y masa bucal será preparado para los experimentos de fuerza del transductor, en el que el ganglio cerebral está unido a los ganglios bucal a través de los CBCs y la masa bucal se encuentra junto a los ganglios bucal a través de los BN2s solamente.
  2. Después de fijar los electrodos de gancho, corte nervio bucal 1 (BN1) y el nervio esofágico (ES) bilateralmente, el corte en el punto de unión a la masa bucal.
  3. Tire del ganglio cerebral hacia adelante para sacarlo del camino del músculo I2. Haga un corte en el músculo I2 sobre el saco radular, extender el corte lateralmente y hacia delante en ambos sentidos, y tire de la solapa del músculo I2 adelante para exponer el nervio radular. Corte las dos ramas de RN y asegurarse de que las ramas son lo suficientemente largas para la fijación de electrodos de aspiración.
  4. Continuar el corte I2 en un amplio círculo alrededor de los ganglios vestibular, teniendo cuidado de no cortar las BN2s o BN3s, hasta el ganglio vestibular y la parte adjunta del músculo I2 puede estar completamente separado de la masa bucal. Cortar las BN3s bilaterales en el punto de unión a la masa bucal, más allá de la fijación del electrodo de gancho.
  5. Aplicar una capa fina de grasa de vacío a la muesca en el plato de grabación descrito anteriormente que conecta la cámara posterior y la plataforma intermedia, utilizando una punta de pipeta para recoger un pegote de grasa de vacío y la extendió sobre la muesca.
  6. Aplique una capa delgada de Quick-Gel pegamento a la parte inferior de cristal de la cámara anterior en la que se coloca la masa bucal, justo en frente de la base Sylgard de la plataforma intermedia.
  7. Transfiera cuidadosamente el ganglio cerebral, ganglios vestibular y bucal masa al plato de grabación (Figura 1) se describe en la sección 2, asegurándose de que ninguno de los electrodos de gancho se tira con fuerza, lo que podría dañar los nervios.
  8. Colocar con cuidado la masa bucal en el pegamento en la cámara frontal del plato de grabación, para asegurar que su superficie ventral está pegado a la parte inferior del plato. Asegúrese de mantener los ganglios y los electrodos de contacto con el pegamento. Añadir Aplysia salina 8 (460 mM NaCl, 10 mM KCl, 22 mM de MgCl 2, 33 mM MgSO 4, 10 mM CaCl 2, 10 mM de glucosa, 10 mM MOPS, pH 7.4 a 7.5) para el plato, que inducirá el pegamento establecer.
  9. Si el plato debe ser transferido a otro microscopio para la preparación de los ganglios bucal para las grabaciones de soma extracelulares, tener mucho cuidado con los electrodos de gancho. Grupo de los electrodos sobre un lado de la masa bucal juntos, y también el grupo de los electrodos en el otro lado de la masa bucal juntos. Cuidadosamente sostener los electrodos agarrando la cinta de laboratorio que cubre los contactos del conector, de nuevo asegurándose de que ninguno de los electrodos se tira con fuerza.
  10. Cuando el plato se coloca bajo el microscopio, el electrodos debe usarse para cubrir suavemente sobre las paredes de la cápsula y el resto en la plataforma al lado del plato.
  11. Durante las pausas y entre las etapas del experimento, airear la solución salina en la cámara de masa bucal utilizando una piedra de aire acuario.
  12. Use pinzas para agarrar la vaina del ganglio cerebral y tire de ella en la cámara posterior, asegurando que los CBCs ejecutar a través de la muesca. Pin el ganglio cerebral utilizando otros nervios de los CBCs para evitar daños a los CBCs intactas.
  13. Aplique más grasa de vacío en los CBC, y luego añadir más solución salina Aplysia a ambas cámaras del plato, para que los ganglios están completamente sumergidos. Asegúrese de que la parte superior de la grasa de vacío es ligeramente superior a la pared Sylgard de manera que no se producirán fugas entre las cámaras.
  14. Para estabilizar los ganglios bucal, primero fijar los extremos de los BN3s, entonces los BN1s y la ENS sobre la base Sylgard de la plataforma intermedia (Figura 2). Desde los BN3s se grabará con electrodo de ganchos, los pasadores deben ser colocados más distalmente que los puntos de fijación de los electrodos de gancho.
  15. Use dos pins, doblado 90 grados, como ganchos para estirar y anclar los CBCs, de modo que los CBCs no será dañado (Figura 2).
  16. Precisar las ramas de RN entre la cámara posterior y los ganglios vestibular. A continuación, el músculo I2 estará en el tope de la RN. Para exponer el nervio I2, use pinzas para agarrar el músculo I2 y tire de ella a través de los ganglios vestibular. Pin dos esquinas del músculo I2 para evitar el daño al nervio I2.
  17. Cortar el nervio I2 distal al punto en el que sus dos ramas se funden en el músculo I2. Asegúrese de que el músculo está inervado todavía a ser comparable a la de las grabaciones in vivo. Corte el resto del músculo I2 y darle la vuelta al nervio I2 atrás y fijarlo abajo entre las dos ramas de RN (véase la figura 2, cuadro).
  18. Ajuste las posiciones de los pines para estirar y añadir tensión si un nervio está demasiado floja, o para liberar la tensión si un nerve es muy apretado. Para estabilizar los ganglios vestibular, agregue más patillas de la vaina entre los nervios.
  19. Puesto que los ganglios bucal se colocan lado caudal hasta, rotar los ganglios bucal si las neuronas de interés están en el lado rostral. Para girar una de las dos ganglios bucal, use unas pinzas finas para tomar algo de vaina superior al CBC en el que está cerca de los ganglios vestibular y el pin hacia abajo entre la BN2 BN3 y el. En algunos ganglios, puede ser más conveniente para precisar entre CBC y BN3.
  20. Añadir un pin adicional en la vaina del ganglio vestibular en el lado cerca de la cámara frontal para reducir al mínimo el movimiento del ganglio vestibular.
  21. Para recortar la vaina que cubre el ganglio vestibular, utilice unas pinzas finas para agarrar la funda en el lado cercano a la cámara de nuevo, a continuación, cortar la vaina sobrante con tijeras finas sin exponer a los cuerpos de las células. Con el fin de minimizar el daño, sólo quitar la cantidad mínima de vaina necesario ver los cuerpos de las células.
  22. Después de tse funda en los ganglios vestibular se recorta, tire del nervio I2 y el RN en el ganglio vestibular y fijarlas entre el ganglio vestibular y cámara frontal para girar aún más el ganglio vestibular. (Ver Figura 2).
  23. Para lavar cualquier cloruro de magnesio restante 8 que se utiliza para anestesiar al animal antes de la disección, reemplazar la solución salina Aplysia en el plato fresco con solución salina Aplysia.

5. Conectar eléctricamente los electrodos de gancho

  1. Después de los ganglios y el músculo se preparan, transferir cuidadosamente el plato a la mesa de aislamiento de vibraciones para los experimentos.
  2. Conecte todas las clavijas de electrodos para las clavijas de los cables BNC que se conectan a los amplificadores (AM Sistemas de amplificador modelo 1700). Una vez más, asegúrese de que los electrodos no se tira con fuerza mientras hace esto. Asegúrese de que los electrodos estén conectados correctamente a sus cables adecuados y que las polaridades son correctas.

6. Configuración de los electrodos de vidrio para las grabaciones extracelulares Soma

  1. Llenar el electrodo con Aplysia salina utilizando una jeringa unida a un pedazo de tubo de polietileno de alrededor de 15-20 cm. Una el extremo libre del tubo de polietileno al extremo del electrodo de vidrio. Tire del émbolo de la jeringa para llenar el electrodo con solución salina Aplysia.
  2. Coloque el electrodo de vidrio llenos extracelular en la muesca del soporte en el manipulador. Utilice el manipulador para colocar la punta del electrodo en la solución salina que contiene Aplysia los ganglios vestibular.
  3. Insertar un alambre de plata / cloruro de plata soldada a un alfiler de oro conector macho en el electrodo para servir como el alambre de grabación. Coloque otro alambre de plata / cloruro de plata soldada a un alfiler de oro conector macho directamente en la solución salina Aplysia dentro de la sección del plato de grabación que contiene el ganglio vestibular para actuar como el cable de referencia. Conecte ambos the grabación y cables de referencia para el cable BNC que se conecta al amplificador.
  4. Si no hay suficiente espacio para más manipuladores, adicionales electrodos de vidrio extracelulares se puede añadir a grabar múltiples neuronas simultáneamente.

7. Configuración de los electrodos de succión para las grabaciones del nervio

  1. Recorte el extremo estrecho de la punta de electrodo de succión para que coincida con el diámetro del nervio. El diámetro interior de la punta del electrodo debe ser similar a, o ligeramente menor que el diámetro del nervio para garantizar succión apretado.
  2. Puesto que el nervio I2 y la RN están muy cerca uno del otro, sus electrodos puede ser sostenido por el mismo manipulador para ahorrar espacio. Coloque dos electrodos en dos escalones del mismo titular. Gire los dos electrodos y asegurar que sus consejos son cerca de uno otro. Elija uno de ellos para la grabación nervio I2, el otro para la grabación de RN.
  3. Coloque la punta del electrodo en la solución salina dentro de la Aplysia recording plato que contiene los ganglios vestibular. Una el extremo libre del tubo de polietileno de la jeringa para el electrodo de succión. Utilice la jeringa para llenar el electrodo con solución salina Aplysia. Mover la punta del electrodo cerca del extremo del nervio objetivo, es decir el nervio I2, y usar la jeringa para aspirar el nervio en el electrodo. La longitud del nervio dentro del electrodo debería ser de aproximadamente 0.5-1.0 mm, para asegurar un sello hermético.
  4. Repetir la aspiración para el electrodo que se adjunta a la RN.
  5. Conecte los electrodos a los cables correspondientes BNC como se describe en la sección 6.3.

8. Configuración del transductor de fuerza para medir la contracción muscular I1/I3

  1. Para conectar los transductores de fuerza para el músculo, utilizar suturas de seda. Doblar la aguja curvada de cada sutura, y atar la sutura para el transductor de fuerza. Suavemente agarrar y levantar una pequeña cantidad de músculo con pinzas y, se mantiene la aguja en otro conjunto de pinzas, insertela aguja a través del músculo hasta el punto de doblado en la aguja (Figura 1).
  2. Transductores se pueden unir ya sea dorsal o lateralmente en el músculo I1/I3. Fijación dorsal permite la medición de las contracciones evocadas por la activación de cualquiera del lado izquierdo o derecho del músculo. Fijación lateral mostrará fuertes fuerzas para la mayoría de las neuronas, pero sólo permitirá la medición de la contracción en el lado al que está unido el transductor.
  3. Para ayudar a identificar las neuronas que pueden activar las regiones anterior, posterior o ambas de I1/I3, conectar un transductor de fuerza a la parte posterior del músculo, justo anterior al tejido faríngeo, y adjuntar otro transductor de fuerza a la parte anterior de la músculo, en las mordazas (Figura 1; ganchos de nota).
  4. Levante los transductores de fuerza hasta que las suturas se tensa, pero no se estire demasiado. Para comprobar esto, ver la medida del transductor de fuerza cuando la sutura tiene un poco de holgura en it, y luego levante el transductor hasta que la medición es ligeramente por encima de este nivel de referencia.

9. La identificación de las neuronas motoras en un Motor Pool

  1. Este protocolo describe un procedimiento para la identificación de las neuronas motoras extracelularmente dentro de una piscina de motor. Se utilizó el software AxoGraph para supervisar la actividad de las neuronas individuales, múltiples nervios y el músculo (señal EMG o las fuerzas de contracción). En este protocolo, se utilizaron las fuerzas de contracción del músculo como una ilustración para el proceso de identificación de las neuronas motoras, y en otros experimentos, se utilizó EMG también, y la configuración de estos experimentos es muy similar (ver Discusión).
  2. Para localizar una neurona candidato, usar el manipulador para presionar suavemente la punta del electrodo de vidrio extracelular hacia abajo sobre la vaina sobre el centro del soma neuronal 5 (Figura 3), que es la mejor ubicación para la estimulación y la selectividad de grabación 5. Puesto que el umbral f actualo la activación de una neurona aumenta linealmente con la distancia de los electrodos-a-soma 5, la selectividad estimulación llegará a ser peor cuando el electrodo se mueve lejos del centro de la neurona diana hacia una neurona vecina.
  3. Para identificar una neurona motora, primero estimulan directamente la neurona mediante el electrodo de vidrio extracelular para garantizar que sólo esta neurona está disparando, y examinar si inerva el músculo. Luego, extracelularmente registro de este neurona a establecer un uno-a-uno entre la grabación soma extracelular y las grabaciones nerviosas, lo cual es también crucial para la identificación de las neuronas.
  4. Como la mayoría de amplificadores extracelulares no permiten la estimulación simultánea y la grabación en un canal, ajustar el canal utilizado para estimular y registrar el soma (el canal soma) a modo de estimulación y aplicar una breve corriente anódica (por ejemplo, 6 ms para Aplysia neuronas 5) a la soma (Figuras 4A, 5A, flechas nota 1 in ambas figuras), a partir de una corriente baja (por ejemplo 200 mu A), y aumentando gradualmente la corriente hasta que las ráfagas de las neuronas.
  5. Una vez que la neurona se activa a punto de estallar, uno debe inmediatamente cambiar el canal de soma del modo de estimulación en el modo de grabación (Figuras 4A, 5A, flechas Nota 2 En ambas figuras). Sin embargo, todavía habrá retrasos entre el soma y la estimulación de grabación debido a los retrasos de respuesta humana.
  6. Si las neurona para una cantidad razonable de tiempo, debe ser posible para observar uno por uno los potenciales de acción correspondientes de la grabación soma y en el nervio (s) a través del cual los proyectos de neuronas (Figuras 4B, 5B, líneas discontinuas nota ), así como las fuerzas generadas por la neurona (Figuras 4A, 5A; cajas para notas azules). Si la neurona deja de disparar antes de la grabación soma comienza, aumentar la corriente para activarlo para un tiempo más largo.
  7. La relación señal-ruido de la extracelulargrabaciones depende de la ubicación y el tamaño de electrodo soma. El registro extracelular se convertirá en más grande como el aumento de tamaño soma y el electrodo a soma disminuye la distancia. Puesto que el ruido sólo varía en un rango estrecho, la relación señal a ruido también aumentará a medida que aumenta el tamaño del soma y de la distancia electrodo-a-soma disminuye. El intervalo más común de la relación de señal-a-ruido es de 4:1 a 8:1.
  8. Las neuronas motoras pueden ser identificados en función de sus características, tales como la ubicación soma, proyección nervio e inervación muscular 4,6,7. Ya que sólo los dos BN2s están unidos a la masa bucal, mediante la supervisión de la actividad en los BN2s, se puede asegurar que la fuerza de contracción muscular sólo es causada por la neurona activada por la estimulación extracelular.
  9. Por ejemplo, B3 es una neurona motora grande para el músculo I1/I3 (300-400 m de diámetro soma en animales que pesan 200 a 350 gramos), situado en el lado rostral del ganglio vestibular (Figura 3 ). Sólo se proyecta a través de la ipsilateral BN2, y ambos inerva las partes anterior y posterior del músculo I1/I3. La mayoría de las veces, se genera una activación anterior más grande que fuerza posterior (8 de 9 experimentos).
  10. Después de una neurona es identificado, su actividad se puede grabar en diferentes comportamientos como la alimentación-a través del electrodo de vidrio extracelular (Figuras 4 y 5), que puede ser obtenido como se describe a continuación. El registro extracelular en el soma será mucho más específicas que las grabaciones nerviosas, que incluyen la actividad de muchas neuronas diferentes.
  11. Para inducir egestive-como los programas de motor, estimular BN2-una con 1-2 min de pulsos 19 (2 Hz, cada pulso es de 1 mseg). Esta estimulación fiable genera patrones egestive en este contexto. Con suficiente corriente (por ejemplo, 300 mu A), los patrones pueden persistir durante la duración de la estimulación. A veces habrá uno más patrón que se produce poco después dela estimulación termina.
  12. Para inducir ingestivo-como los programas de motor, colocar unos pocos cristales de carbacol sólido directamente en la vaina del ganglio cerebral 15. Si se desea controlar el nivel de exposición carbacol, utilizar una solución de carbacol 1 a 10 mM en solución salina Aplysia. Concentraciones más altas son más propensos a inducir respuestas. Patrones repetitivos generalmente comienzan dentro de los cinco minutos, y puede durar unos diez o quince minutos antes de empezar a correr hacia abajo.
  13. Después de lavar carbachol varias veces y espera por lo menos 30 min, una solicitud posterior de carbacol se puede añadir a la ganglio cerebral para inducir a más ingestivo-como patrones motores.
  14. Después de múltiples neuronas de motor para el motor de la piscina particular, han sido identificados y caracterizados durante los programas de motor, se puede desarrollar un método simplificado en gran medida de diagnóstico que requiere información mínima para identificar rápidamente estas neuronas en el trabajo futuro (Figura 6 </ Strong>), por ejemplo, en la preparación de masas suspendidas bucales o in vivo. Los criterios pueden incluir el tamaño y la ubicación soma, la proyección del nervio, tamaño de la unidad de los nervios, y el tiempo de actividad durante los patrones motores.

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Resultados

Las figuras 4 y 5 muestran los resultados típicos utilizados para identificar dos I1/I3 neuronas motoras. Figura 4 muestra las grabaciones de soma de una neurona motora grande, B3, durante patrones egestive-como y como ingestivo-(Figuras 4C, 4D). El uno por uno los picos correspondientes en el canal de soma y el canal BN2 ipsilateral (Figura 4E) muestran que la especificidad de B3 grabación soma se mantuvo durante los patrones. B3 dispa...

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Discusión

En los animales con grandes neuronas identificadas, tales como moluscos (por ejemplo, Lymnaea, Helix y Aplysia), el análisis de los conjuntos motores se realiza normalmente mediante registro intracelular 1,2,3,4. En este protocolo, se describe un procedimiento para la identificación exclusiva de las neuronas motoras para una piscina de motor usando una técnica extracelular. Se utilizaron las mediciones de la fuerza como una ilustración de este proceso. También se podría utilizar para medir E...

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Divulgaciones

No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por el NIH subvención NS047073 y NSF subvención DMS1010434.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre Empresa Número de Catálogo Comentarios
De cloruro de sodio Fisher Scientific S671 Biológica Certificada
El cloruro de potasio Fisher Scientific P217 Certificado ACS
Magnesio hexahidrato de cloruro Acros Organics 19753 99%
Magnesio heptahidrato de sulfato Fisher Scientific M63 Certificado ACS
Cloruro de calcio dihidrato Fisher científca C79 Certificado ACS
La glucosa (dextrosa) Sigma-Aldrich G7528 BioXtra
MOPS Buffer Acros Organics 17263 99%
Carbachol Acros Organics 10824 99%
Hidróxido de sodio Fisher Scientific SS255 Certificado
Ácido clorhídrico Fisher Scientific SA49 Certificado
Un solo cañón capilar de vidrio Sistemas AM 6150
Flaming-Brown micropipeta extractor modelo P-80/PC Sutter Instruments Incandescencia utilizada: FT345B
Esmalte de alambre recubierto de acero inoxidable California alambre fino 0.001D, recubrimiento h
Hogar de silicona Pegamento II GE
Duro Quick-Gel superglue Henkel corp.
Sistemas de amplificador AM modelo 1700 Sistemas AM Configuración del filtro: 10-500 Hz para el nervio I2 / muscular, 300-500 Hz para todos los otros nervios
Pulsemaster multicanal Estimulador World Precision Instruments A300
Estímulo Isolator World Precision Instruments A360
AxoGraph X AxoGraph Científico Software para grabaciones
Alfileres de oro del conector Bulgin SA3148 / 1
Oro Conector Sockets Bulgin SA3149 / 1
Sylgard 184 de elastómero de silicona Dow Corning
100 x 15 mm crystalizing Dish Pirex
Grasa de alto vacío Dow Corning
Puntas de pipetas Fisher Scientific 21-375D
Minutien Pines Herramientas Artes Ciencias 26002-10
Modelado de la arcilla Sargent Art 22-4400
Susurro Bomba de aire Tetra 77849
Acuario Tubing Eheim 7783 12/16 mm
Elite Difusor Hagen A962
Tijeras Vannas Primavera Herramientas Artes Ciencias 15000-08
Dumont # 5 pinzas finas Fine SciencHerramientas electrónicas 11254-20
Kimwipes Kimberly-Clark 34155

Referencias

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