Codificados genéticamente herramientas optogenético permitir la manipulación no invasiva de neuronas específicas en el Drosophila Cerebro. Estas herramientas pueden identificar neuronas cuya activación es suficiente para provocar o suprimir conductas particulares. Aquí presentamos un método para activar Channelrhodopsin2 que se expresa en neuronas específicas en las moscas con libertad para caminar.
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Optogenético estimulación de comportamiento de escape en
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Resumen
Resumen
Un número creciente de herramientas codificados genéticamente se están haciendo disponibles que permiten la manipulación no invasiva de la actividad neuronal de neuronas específicas en Drosophila melanogaster 1. El principal de ellos son herramientas optogenética, que permiten la activación o silenciamiento de neuronas específicas en el animal intacto y moverse libremente con luz brillante. Canalrodopsina (ChR2) es un canal catiónico activado por la luz que, al ser activado por luz azul, causa la despolarización de las neuronas que lo expresan. ChR2 ha sido eficaz para la identificación de las neuronas esenciales para comportamientos específicos, como el CO 2 evitación, la extensión y la probóscide gigante de fibra de respuesta de sobresalto mediada por 2-4. Sin embargo, como las fuentes de luz intensas utilizados para estimular ChR2 también estimular fotorreceptores, estas técnicas optogenético no se han usado previamente en el sistema visual. Aquí, combinamos un enfoque optogenético con una mutación que afecta a la fototransducción demostraciónnstrate que la activación de un grupo de neuronas sensibles al telar en lóbulo óptico de la mosca, Foma-1 neuronas, puede conducir a un comportamiento de escape utilizado para evitar la colisión. Se utilizó un alelo nulo de un componente crítico de la cascada de la fototransducción, fosfolipasa C-β, codificada por el gen Norpa, para hacer que la recta ciego y también utilizar el sistema de transcripción Gal4-UAS activador para conducir la expresión de ChR2 en la Foma-1 neuronas. Moscas individuales están colocados en una pequeña plataforma rodeada por LEDs azules. Cuando los LEDs se iluminan, las moscas rápidamente despegue en vuelo, de una manera similar a la impulsada visualmente telar de escape de comportamiento. Creemos que esta técnica se puede adaptar fácilmente para examinar otras conductas en movimiento libre moscas.
Introducción
Un creciente arsenal de herramientas codificados genéticamente han sido desarrollados para manipular la actividad neural en células específicas en Drosophila melanogaster 1. Estas herramientas permiten la activación no invasivo o el silenciamiento de neuronas específicas en el animal intacto y moverse libremente. Entre estos, Channelrhodopsin2 (ChR2), un canal catiónico activado por la luz, ofrece ventajas, ya que puede ser controlado temporalmente y se indujo rápidamente. Cuando las neuronas que expresan ChR2 están expuestos al brillante azul (470 nm) que rápidamente despolarizar y presentan elevadas tasas de disparo 3-5. Esa activación selectiva de neuronas específicas en animales libres de movimiento ha puesto de manifiesto la suficiencia de las neuronas particulares de comportamientos tales como el CO 2 evitación 3, probóscide extensión 2,4, y el gigante de fibra respuestas de sobresalto mediadas 4. Sin embargo, como las fuentes de luz intensa necesarias para estimular ChR2 también estimular fotorreceptores, aplicando optécnicas genéticos en el sistema visual ha sido limitada. Mediante la combinación de un enfoque optogenético con una mutación que afecta la fototransducción, hemos demostrado que la activación de un conjunto específico de neuronas en el lóbulo óptico de la mosca puede conducir el comportamiento de escape utilizado para evitar la colisión 6.
La mayoría, si no todos, los animales visuales exhiben un comportamiento de escape para evitar colisiones con objetos que se aproximan. Caminar o moscas estacionario, cuando se le presenta una colisión inminente, el despegue en el vuelo, alejándose de la colisión inminente 7-9. Los despegues se caracterizan por las alas planteadas antes del despegue y una trayectoria de vuelo inestable 10,11. Esta respuesta es distinta de la gigante de fibra de la respuesta mediada por sobresalto, saltos que no van precedidos de alas levantadas, y suele dar lugar a una caída en caída libre 4,9. Después de haber identificado un grupo específico de neuronas sensibles al telar en el lóbulo óptico, Foma-1 las neuronas, que son uniquely sintonizado para codificar objetos que se aproximan, hemos tratado de investigar su implicación en el comportamiento de la mosca telar escape. Aquí se demuestra el uso de la optogenética para activar selectivamente estas neuronas y provocar el comportamiento de la mosca de escape.
Utilizamos el sistema transcripcional Gal4-UAS activador para conducir la expresión de ChR2 en las neuronas Foma-1. ChR2 requiere el cofactor todo-trans-retinal y como esta se encuentra en niveles bajos en la Drosophila sistema nervioso central que debe ser complementado en la dieta de las moscas. 3,4 Cuando la luz brillante se utiliza para activar ChR2 y moscas exhiben comportamientos fuertes fototácticas 12, hemos tratado de eliminar la posibilidad de una respuesta al estímulo visual. Para ello, se utilizaron animales que eran mutantes homocigóticos para un alelo nulo del gen Norpa, que codifica un componente crítico de la cascada de la fototransducción, fosfolipasa C-β. Los fotorreceptores en estas moscas mutantes son incapaces de resd a la luz 13. Para probar la estimulación optogenético de la respuesta de escape, tenemos que aislar una sola mosca y se bañan en luz azul brillante. Para ello, ponemos moscas individuales en puntas de pipeta. Una punta de la pipeta se coloca en un soporte de ratón, de tal manera que la mosca geotactically caminará hasta la punta y hacia fuera sobre una plataforma rectangular. La mosca es capaz de caminar libremente alrededor de la parte superior de esta plataforma. La plataforma está rodeada por cuatro matrices de LED de color azul, cada uno con 3 LEDs, centrados en la parte superior de la plataforma. Después de la mosca está en la plataforma, los LED se iluminan, y la respuesta de la mosca se graba con una cámara de alta velocidad 6.
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Protocolo
1. Generar moscas canalrodopsina
- Cruz UAS-ChR2 moscas con el controlador de Gal4 de su elección, se utiliza G105-Gal4, que se expresa en Foma-1 neuronas en el lóbulo óptico.
- Para eliminar la posibilidad de una respuesta visual a la estimulación de la luz azul, ambas líneas de mosca son en fondo aw + Norpa.
- Resultado final: w + Norpa; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Después de moscas adultas eclose, poner las hembras seleccionadas en alimentos frescos, complementado con 10 mM todo-trans-retinal (un co-factor necesario para ChR2) y protegido de la luz, durante 3 días antes de realizar el ensayo de comportamiento.
2. Hacer 10 mM todo-trans-retinal Food mejorada
- Disolver 100 mg de todo-trans-retinal en 17,6 ml de etanol al 95% para hacer 20 mM de retina. Mantener todo-trans-retinal protegido de la luz en todo momento.
- Derrita la comida estándar mosca harina de maíz en el microondas y dejar enfriar hasta que esté caliente al tacto.
- Mezclar 50 l de 20 mMtodo-trans-retinal en viales de 10 ml de alimentos mosca.
- Deje enfriar los viales y mantener protegido de la luz.
3. Equipo
- Puntas de pipeta estándar: 1.000 puntas de pipeta mu l se cortan cerca de la punta, creando un diámetro de poro de ~ 2,25 mm.
- Plataforma (ver Figura 1).
- Una base de Delrin, 17 cm x 25 cm, se construyó con agujeros roscados en cada esquina para adaptarse a ¼ "NPT conectores de mangueras de refrigerante.
- Un soporte vertical, hecha de Delrin, está unida al centro de la base. Las dimensiones totales son de 25 mm X 40 mm X 65 mm (ancho x profundidad x altura). Una ranura 10 mm de ancho corre a lo largo del soporte, con un tornillo de pulgar en la parte inferior. Una plataforma está unida a la parte superior del soporte, 25 mm X 40 mm X 10 mm, con un agujero de 3,5 mm de diámetro alineado con la ranura en el soporte.
- Matrices de LED (ver Figura 1).
- Cuatro brazos de manguera de refrigerante, ~ 18 cm de largo, están fijadas a la plataforma base utilizando el conector de la manguera del refrigerante. Refrigeracion sólo se utiliza como soporte estructural y no se utiliza para fines de refrigeración.
- Ranuras adecuadamente espaciados se cortan en la pieza final de una manguera de refrigerante de cada brazo para la colocación del disipador de calor al extremo de cada brazo.
- A Rebel LED azul Tri-Stars está montado en cada disipador de calor con pre-corte de cinta adhesiva térmica. Un Carclo 18 ° Tri-lente está fijado a cada Tri Star-.
- LED Tri-Star se conectan a los conductores BuckPuck de CC y una fuente de alimentación como se especifica. Hemos organizado nuestra puesta a punto con cada BuckPuck alimentar dos Tri-Stars en serie.
- La iluminación de los cuatro LED Tri-Stars a 700 mA produjo una irradiancia de 713 W / m 2 en nuestra plataforma.
- Cámara: La cámara está montada en un trípode pequeño y centrado en la parte superior de la plataforma.
4. Ensayo de comportamiento
- En pocas palabras anestesiar a las moscas en hielo.
- Coloque las moscas individuales en puntas de pipeta, utilizando cinta adhesiva para cerrarAmbos extremos de la punta.
- Después de que las moscas se han despertado y están explorando activamente la punta de la pipeta, retire la cinta y coloque una pipeta en la ranura en el soporte vertical. El tornillo de apriete manual se utiliza para asegurar la punta de la pipeta en su lugar y para cerrar la parte inferior de la punta.
- Como la mosca explora la punta de la pipeta (típicamente 30 - 60 seg), inicie la grabación de la cámara justo antes de la mosca emerge desde la punta a la plataforma.
- Después de la marcha se ha convertido en la plataforma, espere 1-2 seco, y encienda el LED azul. Use un cronómetro para medir manualmente el tiempo hasta que la mosca inicia vuelo.
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Resultados
Blind vuela manifieste ChR2 o el controlador G105 sólo muestran una baja tasa de despegue después de su iluminación con luz azul brillante. Blind vuela exhibió la misma velocidad de despegue sin iluminación (Figura 2), lo que sugiere que estos despegues eran espontáneas y no debido a la iluminación con luz azul. Cuando el ChR2 se expresa en las neuronas Foma1, sin embargo, la irradiación con luz azul provoca la respuesta de escape. Más del 50% de las moscas ensayadas despegó dentro de 1 segundo de ilumi...
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Discusión
Hemos demostrado la estimulación optogenético de conductas de escape por el baño de caminar libremente las moscas a la luz azul brillante. Este enfoque puede ser fácilmente adaptado para examinar otros comportamientos en moscas libremente a pie, y se puede escalar a grandes plataformas simplemente embaldosado las matrices de LED se utilizan sobre un área mayor. Utilizando cualquiera de la cámara de bajo costo que estamos describiendo, o en otros sistemas de cámara disponibles, el usuario puede adaptar la velocidad...
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por becas del Decano de Stanford (SEJdV), los Institutos Nacionales de Premio Pioneer del Director de Salud (TRC DP0035350), Premio de la Fundación McKnight Scholar (TRC) y R01 EY022638 (TRC).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo | |||
| Todo-trans retinal | Avance Científico y Química Inc | R3041 | |
| Equipo | |||
| Heat Sink 9.2 C / W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm X 30 mm cuadrado alto |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Rebel LED azul en Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA DC BuckPuck controlador | Luxeonstar | 3021-DE-700 | |
| Arnés de cableado para el controlador BuckPuck | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-corte de cinta adhesiva térmica | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Base hexagonal |
| Snap-Loc Refrigeracion, ¼ "ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Conector de la manguera del refrigerante | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼ "NPT macho |
| Laboratorio Grado de cambio de modo programable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim cámara | Casio | EX-FH20 |
Referencias
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
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- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
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- Hammond, S., O'Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
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Reimpresiones y permisos
