Optogenético estimulación de comportamiento de escape en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Resumen

Codificados genéticamente herramientas optogenético permitir la manipulación no invasiva de neuronas específicas en el Drosophila Cerebro. Estas herramientas pueden identificar neuronas cuya activación es suficiente para provocar o suprimir conductas particulares. Aquí presentamos un método para activar Channelrhodopsin2 que se expresa en neuronas específicas en las moscas con libertad para caminar.

Resumen

Un número creciente de herramientas codificados genéticamente se están haciendo disponibles que permiten la manipulación no invasiva de la actividad neuronal de neuronas específicas en Drosophila melanogaster ^1. El principal de ellos son herramientas optogenética, que permiten la activación o silenciamiento de neuronas específicas en el animal intacto y moverse libremente con luz brillante. Canalrodopsina (ChR2) es un canal catiónico activado por la luz que, al ser activado por luz azul, causa la despolarización de las neuronas que lo expresan. ChR2 ha sido eficaz para la identificación de las neuronas esenciales para comportamientos específicos, como el CO ₂ evitación, la extensión y la probóscide gigante de fibra de respuesta de sobresalto mediada por ^2-4. Sin embargo, como las fuentes de luz intensas utilizados para estimular ChR2 también estimular fotorreceptores, estas técnicas optogenético no se han usado previamente en el sistema visual. Aquí, combinamos un enfoque optogenético con una mutación que afecta a la fototransducción demostraciónnstrate que la activación de un grupo de neuronas sensibles al telar en lóbulo óptico de la mosca, Foma-1 neuronas, puede conducir a un comportamiento de escape utilizado para evitar la colisión. Se utilizó un alelo nulo de un componente crítico de la cascada de la fototransducción, fosfolipasa C-β, codificada por el gen Norpa, para hacer que la recta ciego y también utilizar el sistema de transcripción Gal4-UAS activador para conducir la expresión de ChR2 en la Foma-1 neuronas. Moscas individuales están colocados en una pequeña plataforma rodeada por LEDs azules. Cuando los LEDs se iluminan, las moscas rápidamente despegue en vuelo, de una manera similar a la impulsada visualmente telar de escape de comportamiento. Creemos que esta técnica se puede adaptar fácilmente para examinar otras conductas en movimiento libre moscas.

Introducción

Un creciente arsenal de herramientas codificados genéticamente han sido desarrollados para manipular la actividad neural en células específicas en Drosophila melanogaster ^1. Estas herramientas permiten la activación no invasivo o el silenciamiento de neuronas específicas en el animal intacto y moverse libremente. Entre estos, Channelrhodopsin2 (ChR2), un canal catiónico activado por la luz, ofrece ventajas, ya que puede ser controlado temporalmente y se indujo rápidamente. Cuando las neuronas que expresan ChR2 están expuestos al brillante azul (470 nm) que rápidamente despolarizar y presentan elevadas tasas de disparo ^3-5. Esa activació....

Protocolo

1. Generar moscas canalrodopsina

1. Cruz UAS-ChR2 moscas con el controlador de Gal4 de su elección, se utiliza G105-Gal4, que se expresa en Foma-1 neuronas en el lóbulo óptico.
2. Para eliminar la posibilidad de una respuesta visual a la estimulación de la luz azul, ambas líneas de mosca son en fondo aw ⁺ Norpa.
3. Resultado final: w ⁺ Norpa; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. Después de moscas adultas eclose, poner las hembras seleccionadas en alimentos frescos, complementado con 10 mM todo-trans-retinal (un co-factor necesario para ChR2) y protegido de la luz, durante 3 días antes de realizar el ensayo de comportamiento.

Resultados

Blind vuela manifieste ChR2 o el controlador G105 sólo muestran una baja tasa de despegue después de su iluminación con luz azul brillante. Blind vuela exhibió la misma velocidad de despegue sin iluminación (Figura 2), lo que sugiere que estos despegues eran espontáneas y no debido a la iluminación con luz azul. Cuando el ChR2 se expresa en las neuronas Foma1, sin embargo, la irradiación con luz azul provoca la respuesta de escape. Más del 50% de las moscas ensayadas despegó dentro de 1 segundo de ilumi.......

Discusión

Hemos demostrado la estimulación optogenético de conductas de escape por el baño de caminar libremente las moscas a la luz azul brillante. Este enfoque puede ser fácilmente adaptado para examinar otros comportamientos en moscas libremente a pie, y se puede escalar a grandes plataformas simplemente embaldosado las matrices de LED se utilizan sobre un área mayor. Utilizando cualquiera de la cámara de bajo costo que estamos describiendo, o en otros sistemas de cámara disponibles, el usuario puede adaptar la velocidad.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
			Reactivo
Todo-trans retinal	Avance Científico y Química Inc	R3041
			Equipo
Heat Sink 9.2 C / W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm X 30 mm cuadrado alto
Carclo 18 ° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Rebel LED azul en Tri-Star Base	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA DC BuckPuck controlador	Luxeonstar	3021-DE-700
Arnés de cableado para el controlador BuckPuck	Luxeonstar	3021-HE
Pre-corte de cinta adhesiva térmica	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm Base hexagonal
Snap-Loc Refrigeracion, ¼ "ID	McMaster-Carr	5307K49
Snap-Loc Conector de la manguera del refrigerante	McMaster-Carr	5307K39	¼ "NPT macho
Laboratorio Grado de cambio de modo programable DC Power Supply	BK Precision	1698
Exilim cámara	Casio	EX-FH20