Marcaje metabólico del ARN recién transcrito para alta resolución Gene perfiles de expresión de la síntesis de RNA, producción y descomposición en cultivo celular

Resumen

El ARN celular total proporciona una plantilla pobres para el estudio de los cambios a corto plazo en la síntesis de ARN y la descomposición, así como la cinética de procesamiento del ARN. A continuación, describimos marcaje metabólico de ARN recién transcrito con 4-tiouridina seguido por biotinilación específico de tiol y la purificación de ARN recién transcrito que permiten superar estas limitaciones.

Resumen

El desarrollo de microarrays de todo el transcriptoma y de secuenciación de nueva generación ha revolucionado nuestra comprensión de la complejidad de la expresión génica celular. Junto con una mejor comprensión de los mecanismos moleculares implicados, las mediciones precisas de la cinética subyacentes se han convertido en cada vez más importante. Aquí, estas metodologías poderosas se enfrentan a grandes limitaciones debido a las propiedades intrínsecas de las muestras de plantilla que estudian, es decir, el ARN celular total. En muchos casos, los cambios en el ARN celular total se producen ya sea demasiado lento o demasiado rápido para representar los eventos moleculares subyacentes y su cinética con suficiente resolución. Además, la contribución de las alteraciones en la síntesis de ARN, el procesamiento, y la decadencia no se diferencian fácilmente.

Recientemente hemos desarrollado alta resolución-perfiles de expresión génica para superar estas limitaciones. Nuestro enfoque se basa en el marcaje metabólico de los recién transcrito de ARN con 4-thiouricenar (por lo tanto también se conoce como 4SU-etiquetado) seguido por rigurosa purificación de ARN recién transcrito utilizando biotinilación específico de tiol y perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Es aplicable a una amplia gama de organismos, incluyendo vertebrados, Drosophila, y levadura. Hemos aplicado con éxito 4SU-etiquetado para estudiar la cinética en tiempo real de las actividades de factor de transcripción, proporcionar mediciones precisas de ARN vidas medias, y obtener nuevos conocimientos sobre la cinética de procesamiento del ARN. Por último, el modelado computacional se puede emplear para generar un análisis integrado, integral de los mecanismos moleculares subyacentes.

Introducción

Perfiles de expresión génica es una herramienta clave usada para estudiar los procesos celulares y la red asociada a la interacción compleja. Los estudios sobre la abundancia de ARNm han sido por lo general el método de elección para obtener conocimientos básicos sobre los mecanismos moleculares subyacentes. El desarrollo de microarrays de todo el transcriptoma ¹ y, más recientemente, de secuenciación de nueva generación de ARN (ARN-ss) ^2-4 alimentó este enfoque. Aunque estas tecnologías han revolucionado nuestra comprensión de la complejidad de la expresión génica celular, se enfrentan a limitaciones importantes debido a las propiedades intríns....

Protocolo

1. Marcaje metabólico con 4-tiouridina

Haga un plan detallado de la configuración experimental / calendario, por ejemplo, cuándo agregar la 4SU de cultivo celular y cuándo cosechar las muestras. Plan de al menos 5 minutos entre cada condición. Sólo el tratamiento de células de un estado a la vez. Maneje max. 3 - 5 platos en un momento dado. Manipular las células tan rápidamente como sea posible para reducir al mínimo los cambios en la temperatura y los niveles de CO _2. Evite la exposición de las células a la luz brillante después de añadir 4SU ya que esto puede dar lugar a la reticulación de RNA 4SU marcados a las proteí....

Resultados

1. Material de Partida y rendimientos esperados

Después de 1 hora (h) de 4SU-exposición recién transcrito de ARN representa cerca de 1 - 4% del total de ARN celular. Este será menor en crecimiento detenido células ya que ya no sintetizan ARN para tener en cuenta para el crecimiento celular / replicación. Al etiquetar durante 1 hora, se recomienda iniciar el ensayo con 60 a 80 g de ARN total. A partir de menos de 30 g del total de ARN resultados en pequeños gránulos de ARN que son difíciles de v.......

Discusión

Metabólicas etiquetado de recién transcrito RNA aumenta sustancialmente el poder de las tecnologías de alto rendimiento como los microarrays y RNA-Seq, proporcionando plantillas más adecuadas para hacer frente a la cuestión biológica de interés. El presente protocolo se sometió a una amplia optimización. Se permite el enriquecimiento> 1.000 veces de ARN recién transcrito y proporciona resultados altamente reproducibles.

El diseño experimental de un experimento de 4SU-etiquetado es de impo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4-tiouridina	Carbosynth	T4509	Prepare 50 mM de caldo en H2O estéril, almacene a -20 & grados; C en alícuotas de 50-500 μ l, deseche el reactivo no utilizado, no vuelva a congelar.
Trizol	Invitrogen	15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)	ADVERTENCIA - ¡CORROSIVO y PELIGROSO PARA LA SALUD! Garantizar el acceso inmediato al antídoto del fenol (PEG-Metanol); Almacenar a 4 °C.
Cloroformo	Sigma	372978	ADVERTENCIA - PELIGROSO PARA LA SALUD
Isopropanol	Sigma	650447
Citrato de sodio, sin nucleasas	Sigma	C8532	Prepare una solución madre de 1,6 M con agua sin nucleasas.
5M NaCl sin nucleasas	Sigma	71386	Solución madre
H2O	Sigma	W4502	Hacer alícuotas de 1 ml en tubos sin nucleasas.
		de precipitación de ARN	1,2 M NaCl, 0,8 M de citrato de sodio en agua libre de nucleasas. Prepárese con anticipación en condiciones estrictamente libres de nucleasas. Almacenar a temperatura ambiente en tubos falcon de 50 ml.
Etanol	Sigma 459844		Úselo con agua libre de nucleasas para preparar etanol al 80%, almacene a -20 ° C.
1 M Tris Cl sin nucleasas, pH 7,5	Lonza	51237	Solución madre
500 mM EDTA sin nucleasas, pH 8,0	Invitrogen	15575-020	Solución madre
10x Tampón de biotinilación (BB)			100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA en agua sin nucleasas, hacer alícuotas de 1 ml.
Dimetilformamida (DMF)	Sigma	D4551
EZ-Link biotina-HPDP	Pierce	21341	Prepare 1 mg/ml de solución madre disolviendo 50 mg de biotina-HPDP en 50 ml de DMF. Un calentamiento suave mejora la solubilización. Tienda a 4 & grados; C en alícuotas de 1 ml.
Phase Lock Gel Tubos pesados 2.0 ml	Eppendorf	0032 005.152	Opcional para la etapa de extracción de cloroformo.
Membrana zeta	BIORAD	162-0153
10x Tampón			100 mM NaOH, 10 mM
EDTA Biotina-oligo			5'-biotina, 25 nucleótidos, cualquier secuencia
Dodecil sulfato de sodio	Fisher	BPE9738	Para 100 ml de solución madre al 20%, agregue 20 g de SDS a 80 ml de PBS pH 7-8 y ajuste el volumen a 100 ml. Mantenga todas las soluciones de SDS de alto porcentaje por encima de 20 °C. Caliente las soluciones deben precipitar ligeramente SDS.
EZ-Link Yodoacetyl-LC-Biotin	Pierce	21333	Prepare 1 mg/ml de solución madre disolviendo 50 mg de yodoacetil-biotina en 50 ml de DMF. Un calentamiento suave mejora la solubilización. Tienda a 4 & grados; C en alícuotas de 1 ml. Genera una biotinilación irreversible y específica de tiol.
Tampón de fosfato solución salina	Gibco	10010-015
Tampón			de manchas de puntos Mezclar 20 ml 20% SDS con 20 ml 1 x PBS pH 7-8 y añadir EDTA hasta la concentración final de 1 mM.
Estreptavidina-rábano picante peroxidasa	Vector Laboratories	SA5004	Almacenar a -20 °C. Mezclar 10 ml 20% SDS con 10 ml 1 x PBS. Agregue 20 μ l Estreptavidina-HRP antes de su uso.
Reactivo ECL	GE Healthcare RNP2109		Utilizar siguiendo las instrucciones del fabricante.
Super RX, Película X-RA, 18x24 cm	Fujifilm	47410 19236
μ Macs Streptavidin Kit	Miltenyi	130-074-101	Guarde las cuentas a 4 °C.
Tween 20	Sigma	P1379
Tampón			100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 en H2O libre de nucleasas.
Ditiothreitol (DTT)	Sigma	43817	Prepare como 100 mM de DTT en H2O libre de nucleasas, siempre prepare fresco antes de usar.
RNeasy MinElute Kit	Qiagen	74204	Almacene las columnas a 4 & deg; C, el resto de los componentes del kit a temperatura ambiente.
Tubos de polipropileno con tapa de rosca de 1,5 ml	Sarstedt	72.692.005	Compatible con Dimetilformamida
Tubos de polipropileno con tapa de rosca de 2,0 ml	Sarstedt	72.694.005	Compatible con Dimetilformamida
Tubos de 15 ml	BD Falcon	352096	Compatible con Dimetilformamida
Tubos de 50 ml	BD Falcon	352070	Compatible con Dimetilformamida
Todas las soluciones/reactivos deben almacenarse a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario.
Equipment
espectrofotómetro UV/VIS	Thermo Scientific	NanoDrop 1000	O equivalente. Utilice un volumen bajo (1-2 μ l) para mediciones de bajas concentraciones de ARN para evitar una pérdida excesiva de muestras.
Tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml	VWR International	525-0153	A diferencia de los tubos estándar de 15 ml, estos toleran hasta 15.000 × g
Centrífuga de alta velocidad	Beckman Coulter	Avanti J-25	O equipo equivalente capaz de alcanzar 13.000× g
Rotor de alta velocidad	Beckman Coulter	JLA-16250	O equipo equivalente capaz de alcanzar 13,000× g
Adaptadores para tubos de 15 ml	Laborgerä te Beranek	356964	O equipo equivalente capaz de alcanzar 13.000× g
Centrífuga de mesa refrigerada	Eppendorf	5430 R	O equivalente.
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer compact	o equivalente.
Soporte magnético	Miltenyi Biotec	130-042-109	Un soporte tiene capacidad para 8 μ Columnas de Macs.
Beca Baño de Agua		SUB Aqua 5	O equivalente.
Escala ultrafina	A& D	GR-202	O equivalente.
E-Gel iBase Power System	Invitrogen	G6400UK	Para geles de ARN; o equivalente.
E-Gel EX 1% geles prefabricados de agarosa	Invitrogen	G4020-01	Para geles de ARN; o equivalente.

sin nucleasas Tampón de unión a la transferencia de puntos bloqueador de lavado