Las mitocondrias asociadas ER membranas (MAM) y glicoesfingolípidos microdominios enriquecidos (GEMS): Aislamiento de cerebro de ratón

Summary

Este procedimiento muestra cómo aislar del cerebro del ratón adulto las membranas de las mitocondrias ER-asociados o mams y los glucoesfingolípidos fracciones enriquecidas microdominio de MAM y preparaciones mitocondriales.

Abstract

Orgánulos intracelulares son estructuras altamente dinámicas con diferentes forma y composición, que son sometidos a células específicas de señales intrínsecas y extrínsecas. Sus membranas son a menudo yuxtapuestos en sitios de contacto definidas, que se convierten en los cubos para el intercambio de moléculas de señalización y los componentes de membrana ^1,2,3,4. Los inter-organellar microdominios de membrana que se forman entre el retículo endoplasmático (ER) y la mitocondria en la apertura de la Ca ^IP3-2 sensible son conocidos canal ⁺ como las mitocondrias asociado-ER membranas o MAMS ^4,5,6. La composición de proteína / lípido y propiedades bioquímicas de estos sitios de membrana de contacto han sido ampliamente estudiados en particular en relación con su papel en la regulación intracelular de Ca ^{2 + 4,5,6.} El ER sirve como el almacén principal de la concentración de Ca ^{2 +,} y en esta capacidad regula una gran variedad de procesos celulares aguas abajo de Ca ^{2 +} señalización, including post-traduccional plegamiento de la proteína y proteína maturation7. Las mitocondrias, por otra parte, mantener la homeostasis del Ca ^{2 +,} por la precarga de concentración citosólica de Ca ^{2 +} evitando de este modo la iniciación de las vías de apoptosis aguas abajo de Ca ^{2 +} desequilibrio ^4,8. La naturaleza dinámica de los mames hace sitios ideales para diseccionar los mecanismos básicos celulares, incluyendo Ca ^{2 +} señalización y regulación mitocondrial de Ca ^{2 +} concentración supervivencia, la biosíntesis de lípidos y el transporte, la energía y el metabolismo celular ^{4,9,10,11,12.} Varios protocolos se han descrito para la purificación de estos microdominios de tejido hepático y células cultivadas ^13,14.

Tomando los métodos publicados anteriormente en cuenta, se ha adaptado un protocolo para el aislamiento de las mitocondrias y MAM desde el cerebro de ratón adulto. Para este procedimiento se ha agregado una etapa de purificación adicional, a saber, una extracción de Triton X100, que enables el aislamiento de la glicoesfingolípido enriquecido microdominio (GEM) de la fracción de los mames. Estas preparaciones GEM comparten varios componentes de proteínas con balsas caveolas y lípidos, derivados de la membrana de plasma u otras membranas intracelulares, y se proponen para funcionar como puntos de encuentro para el agrupamiento de proteínas receptoras y para las interacciones proteína-proteína ^4,15.

Protocol

El siguiente protocolo está diseñado para el aislamiento y purificación de MAM y gemas de cerebro de ratón

Soluciones necesario para el aislamiento de las mitocondrias, MAM y gemas

Fraccionamiento de obtener preparación mitocondrial crudo:

Solución A: 0,32 M sacarosa, 1 mM NaHCO _3, 1 mM MgCl _2, 0,5 mM CaCl ₂ + Inhibidores de la proteasa (añada fresca, según sea necesario)

Solución B: 0,32 M de sacarosa, 1 mM NaHCO ₃ + Inhibidores de la Proteasa (agregar fresco, según sea ne....

Results

Basándonos en nuestra experiencia con el uso de este protocolo con seguridad puedo recomendar para el aislamiento y purificación de MAM, gemas y fracciones mitocondriales de cerebro de ratón. El procedimiento presentado es altamente reproducible y consistente. En la Figura 1 se muestra una imagen representativa de la forma pura capa de mitocondrias y MAM en un gradiente de Percoll (paso 3,4). De una banda definida, lechoso que contiene purificó mitocondrias (Mito-P) se segrega en la parte inferior del t.......

Discussion

Los sitios de contacto entre las membranas intracelulares o entre orgánulos y la membrana plasmática de las células dinámicas representan plataformas de señalización para los procesos celulares básicos. La caracterización exacta de su función y composición, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas requiere protocolos de purificación fiables y reproducibles. Los métodos detallados aquí han sido específicamente optimizada por nuestro laboratorio para el aislamiento y purificación de los MAM y sus gemas correspon.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo / material	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
			REACTIVOS
			Fraccionamiento
Sacarosa	Fisher Scientific	S5-500
Bicarbonato de Sodio	Sigma-Aldrich	S-5761
Cloruro de magnesio, hexahidratado	Fisher Scientific	BP214-500
Cloruro de calcio, dihidrato	Sigma-Aldrich	C-5080
			MAM
D-Manitol	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Hepes	Fisher Scientific	BP310-500
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378-250G
BSA, fracción V, choque térmico, liofilizado	Roche	03-116-964-001
Percoll	GE	17-0891-02
			GEM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500 ml
Cloruro de Sodio	Fisher Scientific	S271-3
Tris Base	Roche	03-118-142-001
HCl	Fisher Scientific	A144S-500
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500
			Común
Inhibidores de Proteasa Tablets, Complete EDTA libre	Roche	11-873-580-001
			EQUIPO
2 ml Douce All-Glass Grinders tejido	Kimble Chase	885300-0002
15 ml tubos de polipropileno cónicos de centrífuga, BD Falcon	BD	352097
30 ml de fondo redondo de vidrio Tubos centrífuga	Kimble Chase	45500-30
15 ml de fondo redondo de vidrio CentriTubos Fuge	Kimble Chase	45500-15
Tubos de ultracentrífuga, con claridad, espesores, mm 14x89	Beckman-Coulter	344059
Parafilm	Cole-Parmer	PM996
Disposable vidrio borosilicato Pipetas Pasteur, 9 "	Fisher Scientific	13-678-20C