El pulmón se perfundieron por tanto la arteria sistémica bronquial y las arterias pulmonares. En la mayoría de las patologías de pulmón, que es más pequeño de la vasculatura sistémica que muestra neovascularización robusto. La cesación del flujo sanguíneo pulmonar promueve la angiogénesis bronquial a paso ligero. Ofrecemos detalles quirúrgicos de la inducción de isquemia arteria pulmonar que promueve la neovascularización bronquial.
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Artículo de método
La angiogénesis en el pulmón de rata isquémico
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Resumen
Resumen
El pulmón adulto se perfunde por tanto la arteria sistémica bronquial y el retorno venoso todo fluye a través de las arterias pulmonares. En la mayoría de las patologías de pulmón, que es más pequeño de la vasculatura sistémica que responde a una necesidad de mejorar la perfusión pulmonar y muestra neovascularización robusto. Isquemia vascular pulmonar inducido por la obstrucción de la arteria pulmonar se ha demostrado que resulta en una rápida angiogénesis arterial sistémica en el hombre, así como en varios modelos animales. Aunque la evaluación histológica de la evolución temporal de la proliferación de la arteria bronquial en ratas se ha descrito cuidadosamente por Weibel 1, los mecanismos responsables de este crecimiento organizado de nuevos vasos no son claras. Ofrecemos detalles quirúrgicos de la inducción de isquemia arteria pulmonar en la rata que lleva a la neovascularización bronquial. La cuantificación de la extensión de la angiogénesis constituye un desafío adicional debido a la presencia de los dos lechos vasculares en el pulmón. Métodospara determinar la angiogénesis funcional basado en inyecciones de microesferas marcadas se proporcionan.
Introducción
Angiogénesis sistémica en el pulmón está bien reconocida. En estados de enfermedad tales como el asma 2, fibrosis pulmonar intersticial 3, 4 cáncer y tromboembolismo pulmonar crónico 5, la vasculatura sistémica en y alrededor de los prolifera pulmonares e invade el parénquima pulmonar. Sin embargo, los modelos animales para el estudio de esta activación diferencial de la sistémico en lugar de la circulación pulmonar son pocos. Quizás el modelo más reproducible de la neovascularización sistémica en el pulmón del mamífero adulto es el que ocurre después de la inducción de isquemia crónica de la arteria pulmonar. La respuesta a la obstrucción de la arteria pulmonar en seres humanos 5-7, 8 perros, cerdos, ovejas 9 10, 11 conejillos de indias, ratas 1, 12, 13, 14 y ratones es la rápida proliferación de la arteria bronquial, así como las arterias intercostales. Los mecanismos responsables de neovascularización sistémicación del pulmón después de la isquemia pulmonar son en gran parte desconocido y no se han estudiado ampliamente. El curso temporal de la angiogénesis bronquial en la rata después de la obstrucción de la arteria pulmonar se ha descrito cuidadosamente en el trabajo histológico de Weibel 1. La extensión de este trabajo en la rata, nuestro laboratorio ha centrado tanto en los factores de crecimiento importantes en este proceso, así como el resultado fisiológico de este neovasculatura en el pulmón. Los resultados demuestran la quimiocina CXC CINC-3 se eleva temprano después de la isquemia y el tratamiento de ratas con un anticuerpo neutralizante para CXCR2, el receptor de CINC-3, atenúa la angiogénesis 13. La vasculatura recientemente establecida bronquial 14 días después de la aparición de la isquemia pulmonar ha demostrado ser anormal con permeabilidad proteína aumentó significativamente 15. La función pulmonar izquierda no mostraba normal de disminución de la capacidad de difusión y una disminución en el volumen pulmonar 15. Aunque la neovasculatura puede tener contributed a la preservación de tejido pulmonar durante la isquemia pulmonar crónica, parece no ser normal y puede contribuir a una disminución sostenida de la función pulmonar.
Quizás uno de los aspectos más curiosos de este modelo se refiere a la distribución espacial de la proliferación de vasos sanguíneos. A pesar de la liberación de factores de crecimiento dentro del parénquima pulmonar por isquemia, la neovasculatura origina en relativamente grandes arterias bronquiales aguas arriba. La arteria bronquial normal surge como una pequeña rama de la aorta e invade el árbol de la vía aérea en la carina. Así, el mecanismo por el cual los factores de crecimiento inducen la fase inicial de la arteriogénesis no está claro. Sugerimos que la rata, con una anatomía vascular similares a los humanos, proporciona una oportunidad única para estudiar los mecanismos responsables de la angiogénesis pulmonar durante la isquemia sistémica. Aunque la obstrucción completa de la arteria pulmonar izquierda es un fenómeno poco frecuente en sujetos humanos,aumento de la vascularidad bronquial parece estar inducida en los pacientes de manera similar cualquiera que sea el sitio y el tamaño de la obstrucción de la arteria pulmonar 16. Por lo tanto, ofrecemos una descripción detallada de la técnica quirúrgica para ligar la arteria pulmonar izquierda en ratas y un medio para cuantificar la magnitud de la angiogénesis.
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Protocolo
Todos los protocolos realizados en ratas han sido aprobados por el Cuidado de Animales Universidad Johns Hopkins y el empleo, y de conformidad con las directrices del NIH. Siempre que sea posible, el animal debe ser preparado quirúrgicamente en un área separada de la zona quirúrgica para minimizar la contaminación de la zona quirúrgica.
1. La anestesia / analgesia
- Rata lugar (ratas Sprague Dawley macho, 125-150 g; Harlan, Indianapolis, IN) en una cámara de inducción infundido con isoflurano 3%.
- Coloque rata anestesiada a bordo cirugía unido al cono de la nariz y el ventilador con 3% de anestésico isoflurano. Utilice una técnica estéril para todos los procedimientos. Coloque rata para asegurar campo quirúrgico estéril.
2. Intubación
- Inmovilizar apéndices en posición supina con cinta quirúrgica.
- Retire rata de cono de la nariz, extender la lengua con unas pinzas acolchadas.
- El uso de calibre 14 intracath con estilete metálico embotado como guía. Deslice atrás paraNgue, en la tráquea.
- Retire estilete metálico dejando intracath plástico blanco en la tráquea. Asegúrese de que la rata es la respiración y el aire fluye a través del tubo.
- Reemplace cono de la nariz con el adaptador directo al catéter, conecte rata para ventilador (90 respiraciones / min; 8 ml / kg volumen corriente; Rodent Ventilator Modelo 683, Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts).
- Aplicar Puralube (Butler Schein, Dublin, OH) ungüento veterinario en los ojos.
3. Toracotomía
- Lugar rata lado derecho hacia abajo, inmovilizar apéndices con cinta quirúrgica.
- Afeitado zona izquierda caja torácica lateral.
- Retire el exceso de piel con pequeña aspiradora.
- Hacer campo estéril al lavarlo con alcohol seguido de bastoncillo con hisopo de povidona-yodo (Dynarex Corporation, Orangebur, NY). Repita este proceso dos veces más (para un total de tres exfoliantes).
- Hacer incisión transversal con tijeras de disección estériles o estériles bisturí en el centro del campo.
- Blunt diseccionar a través de layers de tejido y grasa a las costillas (última capa es una membrana delgada que cubre las costillas).
- Cuente costillas para determinar 3 º espacio intercostal.
- Usando estériles 45 ° Graefe forceps, hacer incisión contundente entre 3 ª y 4 ª costilla.
- Inserte separadores costales, tire suavemente creando vacío abierto con la visualización completa del pulmón, cinta en lugar de suturas para mantener abierta.
4. Ligadura de la arteria pulmonar izquierda
- Con 90 ° fórceps Graefe, mueva pulmón izquierdo hacia atrás con la mano derecha.
- Usando patrón Dumont # 5 pinzas rectas, coge la arteria pulmonar izquierda y la vía aérea con la mano izquierda. Arteria pulmonar izquierda se colocará sobre la parte superior de las vías respiratorias. Asegúrese de que los fórceps son directamente perpendicular a la mesa. Adicionalmente, es más efectivo para recoger la arteria pulmonar izquierda / bronquio izquierdo mainstem en la posición más distal (la más cercana al parénquima). Empuje la ventilación pulmonar izquierdo a un lado con esta maniobra la mano izquierda.
- Utilice Dumontpatrón # 5 45 ° pinzas curvas para separar la arteria pulmonar izquierda desde el bronquio principal izquierdo en sus fronteras naturales. Esta línea de separación aparece delgada y blanca entre las dos estructuras individuales.
- Separe directamente debajo de la arteria sin pasar por el buque; suavemente deslice las puntas de las pinzas unidas a lo largo de la separación.
- Continúe hasta que las puntas de pinzas han visiblemente separado de la arteria pulmonar izquierda y el bronquio principal izquierdo. Sólo un pequeño punto de la punta debe estar completamente a través. Si la sangre se puede visualizar en la punta de las pinzas, entonces no es completamente a través de la ligadura y no debe intentarse. Una vez atravesado el espacio, la arteria pulmonar izquierda se colocará sobre la curva de los fórceps. Mantener en esta posición.
- Libere suavemente agarre pinza recta romo (mano izquierda) y tomar parte de una sutura precortada (~ 2.3 pulgadas, el tamaño de sutura de polipropileno 6-0; Myco médicos, Cary, NC).
- Abra pinzas curvas acunando arteria pulmonar izquierda y grab sutura. Tire suavemente de sutura a través del espacio entre la arteria pulmonar izquierda y bronquio izquierdo mainstem en un movimiento hacia arriba respecto a la curva de los fórceps.
- Ate ocluir la arteria pulmonar izquierda con un nudo cuadrado, el resto cuidadosamente recorte de sutura.
- Cerrar costillas utilizando pinzas romas para mantener costilla y la sutura dos veces con polipropileno (monofilamento azul) tamaño 4-0 mm unida a un 19, 3/8 círculo inverso corte aguja (Myco Medical, Cary, NC) en una pinza hemostática, teniendo cuidado de no piel sutura (sólo costillas).
- Completar un nudo flojo, inflar los pulmones, en lugar positiva al final de la espiración (PEEP; 2-5 cm H 2 O), hyperinflate nudo pulmón luego asegure con fuerza, y hacer otro nudo completo antes de cortar con tijeras resto de sutura. Eliminar de la PEEP y visualizar durante 30 segundos para asegurar que el pulmón no se colapsa. Aplicar 5 gotas bupivicaína (APP Pharmaceuticals, Schaumbur, IL).
- Cerrar piel mediante la colocación de adhesivo tisular en heridas y empujar la piel junto con parte posterior end de aplicador de punta de algodón. Dar bupivicaína (2,0 mg / kg por vía subcutánea) en el sitio de incisión posteriormente cada 8 h durante 24 horas o hasta que el animal se reanuda la actividad normal. Como la capa subcutánea en esta zona es muy delgada, no es fácil de suturar en su propio. Cuando el pegamento se aplica el tejido y la piel se empuja juntos también cierra la capa subcutánea.
- Apague el gas isoflurano, pero siguen ventilar la rata durante 1-2 min en aire ambiente hasta que se recupere el movimiento voluntario. Desconecte el tubo endotraqueal del ventilador y asegúrese de que la rata está respirando espontáneamente antes de retirarlo.
- Limpie Puralube de los ojos con un hisopo de algodón y movimiento del monitor y la recuperación. Inyectar hidrocloruro de buprenorfina (0,05 mg / kg intraperitoneal, Butler Schein, Dublin OH). Continuar la entrega de analgésico cada 12 horas durante 48 horas después de la cirugía.
5. La canulación arteria carótida
Para evaluar la magnitud de perfus bronquialesion del pulmón izquierdo isquémico en puntos de tiempo deseados después de la ligadura de la arteria pulmonar izquierda, inyectar microesferas marcadas a través de la arteria carótida izquierda en el arco aórtico. Preparar ratas como arriba 1-2.
- Cortar a lo largo de la línea media del cuello, embotar diseccionar a revelar tráquea y la arteria carótida izquierda (sitio de la inyección de microesferas).
- Insertar catéter lleno con solución salina heparinizada punta, romo de PE20 tubo (Becton Dickinson, Sparks MD) en el recipiente conectado a la aguja 25 g, 4-way llave de paso, jeringa de 1 ml.
- Coloque la botella de microesferas (15 micras carmesí poliestireno microesferas fluorescentes, 1 x 10 6 esferas / ml; Invitrogen, Eugene, OR) en sonicador de agua durante 30 seg.
- Extraiga la botella y agitar y preparar 0,5 ml (500.000 microesferas) en un 1 ml jeringa de vidrio Hamilton (Hamilton Company, Reno, NV) a través de una aguja de 20 g.
- Conecte una jeringa Hamilton de llave de paso de cuatro vías e infundir microesferas con bomba de jeringa (velocidad: 500 l / min; Genie Plus, Kent Científico, Torringten, CT).
- Retire la jeringa Hamilton y aparato ras con 1 ml de solución salina heparized a 500 l / min.
- Realizar toracotomía pecho lleno y exsanguinate la rata por la ruptura de la vena cava inferior.
- Retire el pulmón izquierdo y en los tejidos de interés.
- Para extraer microesferas a partir de tejido, tomar todo el pulmón izquierdo de la rata después de la exanguinación y colocarlo en KOH 2M (4-6 ml). Colocar en un baño de 55 ° C el agua y dejar toda la noche para la digestión del tejido. Añadir Tween 80 (0,25%) para lavar las perlas, vórtice (10 segundos) y se centrifuga (2.000 rpm, 20 ° C durante 10 min). Eliminar el sobrenadante, añadir acetato de 2-etoxietilo (1 ml) y agitar y dejar reposar durante 1 hora. Vortex la suspensión y se centrifuga (2.000 rpm; (20 ° C durante 10 min) Remover la capa de acetato de 2-etoxietilo acuosa que contiene la fluorescencia, lugar en una cubeta y medida utilizando un Hitachi F-2500 espectrofotómetro de fluorescencia (excitación 618 612/emission. ; Digilab, Holliston, MA).
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Resultados
Reparto vascular: Resultados de los efectos de la isquemia arteria pulmonar izquierda en la rata se muestra en la Figura 1. Se muestra un reparto de metacrilato de la vasculatura bronquial y la vascularización extensa del árbol de las vías respiratorias izquierda 28 días después de LPAL. Para obtener este molde, la vasculatura sistémica se inyectó con una mezcla de metacrilato (rojo), retrógrada en la aorta descendente y de la tráquea se canuló y se inyecta con un material a base de silicona blanca. Est...
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Discusión
La ligadura de la arteria pulmonar izquierda en todas las especies estudiadas conduce a la neovascularización robusto sistémica del pulmón isquémica. Hemos presentado los detalles de la técnica quirúrgica en un modelo de rata. Nuestros resultados vascular producido por fundición, histopatología, y en el etiquetado in vivo demuestran que las arterias bronquiales proliferan y perfundir el parénquima pulmonar. Por lo tanto, los mecanismos de la angiogénesis bronquial puede ser estudiada en un modelo anima...
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Reconocemos la labor del Dr. Adlah Sukkar, MD para ayudar con la colada del pulmón. Este trabajo ha sido financiado por el NHLBI, HL088005.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos: | Empresa | ||
| hidrocloruro de buprenorfina, Puralube | Mayordomo Schein | ||
| bupivicaína | APP Pharmaceuticals | ||
| Povidona Yodada bastoncillo con hisopo | Dynarex Corporación | ||
| polipropileno tamaño de la sutura 6-0, 3/8 círculo inverso aguja de corte | Myco Médico | ||
| PE20 tubo | Becton Dickinson | ||
| 15 micras fluoroesferas de poliestireno carmesí | Invitrogen | ||
| 1 ml vidrio de la jeringa Hamilton | Hamilton Company | ||
| Equipamiento: | |||
| Genie Plus bomba de jeringa | Kent Científico | ||
| Espectrofotómetro de Fluorescencia | Digilab | ||
| Rodent Ventilator Modelo 683 | Harvard Apparatus | ||
| Tabla 1. Tabla de reactivos y equipos específicos. |
Referencias
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