Rapid ensayos colorimétricos para distinguir cualitativamente ARN y ADN en muestras Biomolecular

Resumen

Un conjunto de ensayos colorimétricos se describe para la proteína rápidamente distintivo, ARN, ADN, y ducing re-azúcares en muestras de biomoléculas potencialmente heterogéneos.

Resumen

Experimentación bioquímica general, requiere el conocimiento exacto, en una etapa temprana, del ácido nucleico, proteína y otros componentes biomoleculares en muestras potencialmente heterogéneos. Los ácidos nucleicos pueden ser detectados a través de varios métodos establecidos, incluyendo métodos analíticos que son espectrofotométrico (por ejemplo, A _260), fluorométrico (por ejemplo, la unión de tintes fluorescentes), o colorimétrico (nucleósidos específicos de reacciones químicas cromogénicos). ¹ A pesar de que no puede distinguir fácilmente ARN a partir de ADN, la A ₂₆₀ / A ₂₈₀ se emplea comúnmente, ya que ofrece una simple y rápida ² evaluación del contenido relativo de ácido nucleico, que absorbe predominantemente cerca de 260 nm y proteínas, que absorbe principalmente cerca de 280 nm. Ratios <0,8 se toman como indicadores de muestras "puras" de proteínas, mientras que el ácido nucleico puro (NA) se caracteriza por relaciones de> 1,5 ^3.

Hobargo, hay escenarios en los que el contenido de proteína / NA no puede ser tan clara o fiable inferirse de simples uv-vis medidas espectrofotométricas. Por ejemplo, (i) muestras podrá contener una o más proteínas que son relativamente carente de los aminoácidos aromáticos responsables de la absorción a 280 nm (≈ Trp, Tyr, Phe), como es el caso con algunos pequeños ARN-proteínas de unión, y (ii) muestras pueden exhibir intermedio A ₂₆₀ / A ₂₈₀ ratios (~ 0,8 <~ 1,5), donde el contenido de proteína / NA es mucho menos clara e incluso pueden reflejar algunos de alta afinidad de la asociación entre la proteína y componentes de NA. Para tales escenarios, se describe en la presente memoria un conjunto de ensayos colorimétricos para distinguir rápidamente ARN, ADN, y azúcares reductores en una muestra mixta potencialmente de biomoléculas. Los métodos se basan en la sensibilidad diferencial de las pentosas y otros hidratos de carbono a Benedict, Bial (orcinol), y reactivos de Dische (difenilamina); los protocolos simplificados puede ser comcompletado en cuestión de minutos, sin ningún paso adicional de tener que aislar los componentes. Los ensayos pueden realizarse en paralelo a diferenciar entre ARN y ADN, así como para indicar la presencia de azúcares libres reductores tales como glucosa, fructosa y ribosa (Figura 1).

Introducción

Gran parte de la biología celular se produce a través de interacciones moleculares que interviene el ADN y el ARN. ⁴ Estos ácidos nucleicos de origen natural (AN) interactúan entre sí, con las proteínas, ⁵ y ⁶ con una serie de compuestos de pequeñas moléculas y ligandos in vivo (por ejemplo, cationes divalentes ^7). Las interacciones pueden ser de corta o de larga duración (cinéticamente), puede variar de alta a moderada a baja afinidad (fuerza termodinámica), y también pueden mostrar una variación sustancial en las propiedades químicas y la especificidad - algunas asociaciones son muy específicas ....

Protocolo

1. Ensayo de Benedicto XVI para la reducción de azúcares

1. Preparar una cantidad apropiada de reactivo de Benedict - 940 mM de carbonato de sodio anhidro, 588 mM de sodio dihidrato de citrato, 68 mM de cobre (II) pentahidrato de sulfato. Este reactivo puede almacenarse a temperatura ambiente (RT) durante al menos seis meses sin ningún cambio notable en la reactividad.
2. El reactivo anterior es 6x. Así, para 600 reacciones mu l, añadir 100 l de reactivo de Benedict a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml (por ejemplo, Eppendorf marca), por muestra a ensayar.
3. Añadir cualquier lugar de 10 l a 500 l de muestra a este tubo, el vol....

Resultados

Los resultados se muestran en la Figura 3 para la aplicación de estos ensayos colorimétricos para los compuestos de referencia conocidos. Los datos representativos se muestran cualitativos para (a), el orcinol Benedict Bial (B), y Dische de difenilamina (c) ensayos, y las curvas de calibración para estos tres ensayos se muestran en la Figura 4. En los paneles 3 (AC), los paneles de la izquierda muestran positivos / negativos experimentos de control usando analitos adecuadamente reactivo.......

Discusión

Los ensayos colorimétricos se presenta aquí ofrecer un enfoque sencillo para evaluar rápidamente la naturaleza química de las mezclas de biomoléculas, tales como se encuentran cuando la purificación de proteínas, ARN o complejos de lisado de células enteras en preparación para estudios posteriores. Como la biología estructural persigue asambleas más similar a la nativa, los retos cada vez mayores, como la heterogeneidad de la muestra, se plantean los complejos complicados y multi-componente. Supramoleculares son a.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo o equipo	Proveedor / empresa	El número de catálogo	Comentarios, notas
Carbonato de sodio anhidro	Fisher Scientific	S263
Sodio dihidrato de citrato	Sigma	S-4641
Cobre (II) sulfato pentahidratado	VWR	VW3312-2
Monohidrato de orcinol	Sigma-Aldrich	O1875
HCl concentrado	VWR	BDH3030
Cloruro de hierro hexahidratado	Sigma	F-2877
Difenilamina	Aldrich	112763
Ácido acético glacial	Fisher Scientific	A28
Ácido sulfúrico	Sigma-Aldrich	258105
Etanol	Koptec	V1101
Ribosa	Sigma	R-7500	prep a 1% w / v en H 2 O
El ácido ribonucleico de levadura (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep a 10 mg / ml en H 2 O; almacenar a -20 ° C
El ácido desoxirribonucleico (sal de sodio), a partir de timo de ternera	Sigma	D1501	prep a 10 mg / ml en H 2 O; almacenar a 4 ° C
			Los reactivos, equipos y Seguridad Los materiales se enumeran en la foguientes tabla en el orden en que aparecen en la sección de Protocolo. A menos que se indique lo contrario (arriba), todos los reactivos pueden almacenarse a temperatura ambiente y la iluminación. Para cualquier artículo no se enumeran a continuación (por ejemplo, tubos de microcentrífuga), la marca habitual / modelo / variedad que se encuentra en un laboratorio de bioquímica estándar se puede utilizar (por ejemplo, Eppendorf de 1,5 ml marca tubos de microfuga). Estándar tubos de microcentrífuga de plástico se debe utilizar para los pasos que implican centrifugación (por ejemplo, para material de sedimento de partículas cerca del final de cada protocolo). Ningún material en particular es preferible, siempre y cuando los tubos puede ser sellada; los tubos de polipropileno típicos que se encuentran en los laboratorios de bioquímica funcionan bien. En cuanto a las preocupaciones de seguridad y eliminación de residuos, las precauciones estándar de laboratorio (gafas de seguridad, campanas de extracción) debe ser ejercida de pre-parar, trabajando, y disponer de soluciones que contienen concentrado acético, clorhídrico o sulfúrico. Para los reactivos orgánicos como orcinol o difteriaenilamina, guantes de nitrilo son preferibles al látex común (caucho natural) variedad.